虎杖治療動脈粥樣硬化物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

，， ，，

據(jù)《中國心血管報告2017》統(tǒng)計，以冠心病和腦卒中為代表的動脈粥樣硬化性心血管病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)占疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國居民的首位死因[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是ASCVD最重要的病理學基礎(chǔ)，現(xiàn)代醫(yī)學認為炎癥反應(yīng)貫穿AS發(fā)生發(fā)展的全過程，AS是動脈壁的慢性炎癥性疾病[2]。以陳可冀院士為首的科研團隊在充分認識AS現(xiàn)代病理生理機制的基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)學對“瘀”“毒”的認識，創(chuàng)新性地提出并驗證了ASCVD“瘀毒”病機理論[3]，活血解毒成為獨具特色的AS中醫(yī)治法[4]。中藥虎杖(Polygonum Cuspidatum，Japanese Fleeceflower)為蓼科草本植物虎杖的干燥根莖和根，其性苦，微寒，具有活血解毒，利濕退黃之功效。現(xiàn)代研究顯示虎杖具有抗炎、改善糖脂代謝、抗AS和血栓形成等藥理學作用[5]。虎杖兼具傳統(tǒng)中醫(yī)學活血解毒之功效和現(xiàn)代藥理學抗炎、調(diào)脂等作用，在AS的防治領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注，本課題組前期開展了活血解毒中藥虎杖防治AS易損斑塊的實驗研究，初步發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定AS易損斑塊的效應(yīng)明顯優(yōu)于單純活血中藥三七和單純解毒中藥黃連[6]，但目前對虎杖治療AS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制仍缺乏系統(tǒng)性認識，有待進一步深入研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是2007年Hopkins率先提出的藥物研發(fā)新理念[7]，其整體性、系統(tǒng)性的優(yōu)勢為多成分、多靶點的中藥復雜系統(tǒng)研究提供了新的思路和策略[8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，篩選虎杖治療AS的活性成分，預(yù)測其潛在分子機制，以期初步闡釋虎杖治療AS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為深入開展虎杖治療AS的基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 虎杖活性成分與潛在靶點篩選 利用北京蛋白質(zhì)組研究中心開發(fā)的生物信息學工具BATMAN-TCM平臺(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索虎杖活性成分，篩選活性成分潛在靶點基因。BATMAN-TCM是目前功能最為全面的中藥作用機制在線分析工具，其基于藥物-藥物相似性和蛋白-蛋白相似性算法預(yù)測中藥活性成分的潛在靶點[9]。檢索參數(shù)設(shè)置為Score cutoff≥20，P-value cutoff<0.05，建立虎杖活性成分-靶點基因數(shù)據(jù)庫。

1.2 動脈粥樣硬化疾病靶點文本挖掘 利用PALM-IST平臺(http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)檢索AS相關(guān)靶點基因，PALM-IST是基于PubMed文本挖掘的信息檢索工具，其可通過關(guān)鍵詞檢索對PubMed數(shù)據(jù)庫所收錄文獻中的相關(guān)疾病靶點基因進行批量文本挖掘，從而實現(xiàn)疾病靶點的獲取。以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞進行文本挖掘。

1.3 成分—靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 獲得虎杖活性成分潛在靶點基因及AS靶點基因后，取兩者交集并進行藥物成分靶點-AS疾病靶點映射，利用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)并進行可視化，藥物活性成分和作用靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示，利用network analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，計算節(jié)點自由度(degree)、介數(shù)(betweenness centrality)、接近中心性(closenesscentrality)、平均最多路徑長度(average shortest path length)等參數(shù)，根據(jù)節(jié)點自由度篩選主要靶點基因并導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，繪制主要靶點基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因富集分析 利用FunRich 3.1.3軟件(http://www.funrich.org/)進行基因富集分析，F(xiàn)unRich是2015年發(fā)布的一款基因富集和網(wǎng)絡(luò)互作分析工具，其通過整合Uniprot、PPD、Gene ontology、KEGG、Reactome、Cellmap、NCI nature等10余個生物信息數(shù)據(jù)庫的基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，形成了超過150萬條注釋的背景數(shù)據(jù)庫，較傳統(tǒng)基因功能分析工具如Ingenuity PathwayAnalysis、MetaCore、DAVID等具有界面友好、多源信息集成和圖形可視化等諸多優(yōu)勢[10]。通過FunRich中的“Gene enrichment”模塊完成生物學過程(biological process)和生物信號通路(biological pathway)富集分析及圖形可視化。

2 結(jié) 果

2.1 虎杖治療動脈粥樣硬化的活性成分與潛在靶點 經(jīng)BATMAN-TCM平臺檢索，共獲得虎杖化學成分70個，其中43個成分具有化學結(jié)構(gòu)和預(yù)測靶標，經(jīng)PALM-IST文本挖掘，共獲得人類AS靶點基因4 163個，取虎杖靶點基因和AS靶點基因交集后，共獲得虎杖治療AS的潛在靶點基因160個，具有治療AS作用的活性成分21個。詳見表1。

2.2 成分—靶點網(wǎng)絡(luò)及靶點互作分析結(jié)果 將虎杖活性成分和作用靶點信息導入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建虎杖治療AS的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，共包含181個節(jié)點(21個成分靶點，160個基因靶點)、316條邊，綠色圓形節(jié)點代表虎杖活性成分，藍色矩形節(jié)點代表作用靶點，詳見圖1。用network analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，得到潛在靶點基因的自由度，自由度越大則表明通過該靶點發(fā)揮作用的可能性越大，自由度≥5的重要靶點基因有PTGS2、PTGS1、PGR、ESR1、ALOX5、VDR、SOX9和MED1，其在網(wǎng)絡(luò)中的具體參數(shù)信息詳見表2，相互作用關(guān)系見圖2。

2.3 基因富集分析 將虎杖治療AS的160個潛在靶點基因?qū)隖unRich完成生物學過程和信號通路富集分析，生物學過程富集分析發(fā)現(xiàn)P<0.05的生物學過程涉及信號轉(zhuǎn)導(signal transduction)、細胞通訊(cell communication)、能量通路(energy pathways)和代謝(metabolism)，詳見圖3；信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)P<0.05的生物信號通路包括維甲酸受體(retinoic acid receptors， RARs)信號通路、維甲酸X受體(retinoic X receptors，RXRs)RXRs和RARs異源二聚體核因子信號通路、生物胺受體信號通路、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腎上腺素能受體信號通路、視紫紅質(zhì)樣受體信號通路、經(jīng)典NF-kappaB信號通路、白介素23(interleukin-23，IL-23)信號通路、TAK/NF-kappaB信號通路、CD40/CD40L信號通路、白介素12(IL-12)信號通路、TLR3/TRIF信號通路、TRAF6/NF-kappaB信號通路、Aurora A激酶信號通路、脂質(zhì)與脂蛋白代謝通路、白細胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路、前列腺素受體信號通路和TLR信號通路等，詳見圖4。

表1 虎杖中21個具有治療AS作用的活性成分

圖1 虎杖治療AS活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 自由度≥5的潛在靶點基因

圖2 自由度≥5的潛在靶點基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 虎杖活性成分治療AS潛在靶點的生物學過程

圖4 虎杖活性成分治療AS潛在靶點的生物信號通路

3 討 論

虎杖藥用歷史悠久，入藥始見于《雷公炮炙論》，傳統(tǒng)中醫(yī)多取其利濕退黃、清熱解毒、活血散瘀之功效，廣泛應(yīng)用于濕熱黃疸、癰腫瘡毒、癥瘕和跌打損傷等病證。隨著對虎杖化學成分和藥理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其主要含有二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類、香豆素類以及脂肪酸類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、調(diào)脂、抗血栓、改善血液流變學、擴張血管、保護心肌等廣泛的藥理學作用[11]。近年來，虎杖在AS的臨床治療和藥理研究中亦展現(xiàn)出較高的應(yīng)用價值和良好的開發(fā)前景。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，首次系統(tǒng)性地探索了虎杖治療AS的活性成分、潛在靶點基因和分子機制。

本研究共發(fā)現(xiàn)具有治療AS作用的虎杖活性成分21個，其中3，5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸(3，5-dimethyl-4-methoxybenzoic Acid)、反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)、白藜蘆醇(resveratrol)、蒽醌(anthraquinone)、大黃素(emodin)、大黃酸(rhein)、大黃素蒽酮(emodin anthrone)、皂皮酸(quillaic acid)、遠志酸(polygalacic acid)和沒食子酸(Gallicacid)等化學成分能作用于10個以上的AS靶點基因，可認為是虎杖治療AS的主要活性成分。從活性成分—作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出同一活性成分可對應(yīng)不同的靶點，不同活性成分也可對應(yīng)相同的靶點，體現(xiàn)出虎杖多成分、多靶點治療AS的作用特點。既往已有大量實驗研究表明上述多種藥效成分具有良好的抗AS作用，其中，以白藜蘆醇和反式白藜蘆醇的研究最為廣泛和深入，白藜蘆醇是虎杖中含量較高的一種二苯乙烯類化合物，反式白藜蘆醇是白藜蘆醇的同分異構(gòu)體，具有與白藜蘆醇相同的生物活性，白藜蘆醇及其衍生物因良好的抗炎、抗氧化、抗衰老和血管保護等作用，被廣泛應(yīng)用于AS的輔助治療中[12]。實驗研究顯示白藜蘆醇及其衍生物可通過多種途徑發(fā)揮抗AS作用，如白藜蘆醇可通過抑制NF-kappaB、MAPK信號通路發(fā)揮抗炎、降脂和抗AS作用[13-14]；通過下調(diào)TRPC1及STIM1基因表達及蛋白水平，抑制SOCC介導的Ca2+內(nèi)流，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達及活性[15]；還可通過誘導巨噬細胞自噬延緩AS進展[16]；反式白藜蘆醇可減少血管壁炎性細胞的招募和炎性趨化因子的表達[17]。大黃素、大黃素蒽酮和大黃酸同屬于大黃蒽醌類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等生物活性[18]，大黃蒽醌類在虎杖中亦有較高的含量，是虎杖的主要特征性成分[19]；大黃素能夠增加ApoE-/-小鼠易損斑塊中過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARγ)的表達，降低粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，增加斑塊穩(wěn)定性[20]；可通過ROS-ERK1/2/p38信號通路上調(diào)PPARγ的表達，抑制血管平滑肌細胞C反應(yīng)蛋白(CRP)的表達[21]；還可通過抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)揮抗AS作用[22]。3， 5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸、皂皮酸、遠志酸和沒食子酸等均屬于有機酸類化學成分，其中3，5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸可作用于65個AS靶基因，研究表明中藥有機酸類成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化等廣泛的藥理學作用，在AS等心血管疾病中具有較高的潛在應(yīng)用價值[23]，虎杖有機酸類成分的抗AS效應(yīng)機制值得進一步深入探索。

經(jīng)靶點映射，共獲得虎杖治療AS的潛在靶點基因160個，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，篩選出PTGS2、PTGS1、PGR、ESR1、ALOX5、VDR、SOX9和MED1等8個重要基因，且8個基因之間存在明確的相互作用關(guān)系，上述基因的相互作用及其下游信號通路有望成為虎杖治療AS的潛在靶點。根據(jù)基因生物學過程富集分析結(jié)果推測，虎杖活性成分可參與細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞通訊、能量通路和代謝等4個生物學過程。根據(jù)基因信號通路富集分析結(jié)果推測，虎杖活性成分可能通過調(diào)控18條生物信號通路中的某些關(guān)鍵分子發(fā)揮抗AS作用。上述多條信號通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，其中經(jīng)典NF-kappaB信號通路、TAK/NF-kappaB信號通路、TLR3/TRIF信號通路、TRAF6/NF-kappaB信號通路、TLR信號通路、CD40/CD40L信號通路、IL-23信號通路和IL-12信號通路均屬于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族及其介導的下游信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。TLRs屬于模式識別受體，迄今為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)10個TLRs，TLRs不僅在天然免疫中發(fā)揮重要的作用，而且還調(diào)節(jié)獲得性免疫，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[24]。TLRs識別各種外源性和內(nèi)源性配體后，其胞內(nèi)尾狀結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白髓樣分化因子88(MyD88)結(jié)合，然后MyD88與IRAK家族相互作用募集TRAF6，激活NF-kappaB和MAPK信號通路，進而促進炎癥因子的分泌[25]。TLRs與AS具有密切關(guān)系，TLRs激活后可通過促進白細胞浸潤、促進脂質(zhì)核心形成、促進纖維帽變薄和促進血管新生等導致AS斑塊易損性增加[26]，推測虎杖可能通過調(diào)控TLRs受體信號系統(tǒng)中多個靶點和環(huán)節(jié)，參與多種病理生理過程，進而發(fā)揮抗炎、抗AS作用。維甲酸受體信號通路也是虎杖治療AS的重要潛在信號通路，目前已鑒定的維甲酸受體有RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ和RXRγ等，分別屬于RARs和RXRs兩個不同核配體激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子超家族，維甲酸受體與維甲酸及其衍生物結(jié)合后被激活，通過維甲酸信號通路發(fā)揮生物學效應(yīng)[27]，在AS中，維甲酸能夠通過維甲酸受體信號通路作用于血管內(nèi)皮細胞凋亡、血管平滑肌細胞增殖、氧化應(yīng)激、炎癥浸潤等AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進而抑制斑塊形成[28]，虎杖活性成分是否具有類維甲酸樣效應(yīng)發(fā)揮抗AS作用值得進一步探索。此外，脂質(zhì)與脂蛋白代謝通路、前列腺素受體信號通路等在介導虎杖抗AS中的作用亦有待進一步研究。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究思路，整合應(yīng)用多種生物信息學工具，對活血解毒中藥虎杖多成分、多靶點、多途徑治療AS的復雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行了系統(tǒng)研究，初步探索和預(yù)測了其治療AS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子生物學機制，為后續(xù)實驗研究進一步驗證其作用機制提供了依據(jù)，也為更加復雜的活血解毒中藥復方治療AS的作用機制研究提供了借鑒。