補腎活血方對抗心磷脂抗體（+）復發性流產患者蛻膜及外周血膜聯蛋白A2和Toll樣受體4的影響研究

馮曉玲，常卓，張璇，陳璐，王煒，趙小萱，趙顏

復發性流產（RSA）是指育齡期婦女與同一性伴侶，連續發生自然流產的次數≥2次的一種妊娠疾病。育齡期婦女RSA發生率約為1%［1］，是一種常見的婦科疑難雜病。盡管對于RSA的病因尚未完全明確，但大多數學者認為免疫因素是重要致病因素，其中抗心磷脂抗體（ACA）（+）是已知的和RSA相關的免疫因素，其通過影響凝血狀態、血栓形成從而可能導致RSA［2-5］。近年來研究表明，RSA發生率與ACA陽性率呈顯著正相關，其可能通過影響凝血狀態、胎盤血管、前列環素/血栓素A2、子宮內膜容受性等進而影響妊娠過程［6］。所以以ACA為靶點一直是相關研究的關注點［7］。西醫學對ACA（+）RSA的治療主要集中在抗血栓形成和免疫抑制等方面，常采用阿司匹林、潑尼松以及低分子肝素等抗凝類藥物進行治療［8］。而祖國醫學則認為ACA（+）RSA屬于滑胎之腎虛血瘀證，并對癥予以補腎活血法，以補腎為本，活血治標進行標本同治，瘀血祛則胎安、腎氣充則胎固，共奏安胎之效。如《內經》中“四烏賊骨——藘茹丸”，是補腎活血法方藥的先河，張錫純“腎氣丸為補腎之藥，實兼為化淤血之藥”的理論，也提出了補腎活血的安胎原則［9］。本研究是在前期補腎活血方治療ACA（+）RSA的經驗［10］基礎上進行的機制研究。本課題組前期研究發現，ACA（+）RSA的發生與Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）炎性通路及其因子有著密切關系［11］，所以本研究探討補腎活血方對TLR4/NF-κB炎性通路上的因子〔膜聯蛋白A2（ANXA2），TLR4〕及評估妊娠結局的指標的調節作用，進而闡述其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 選取2015年3月—2016年3月在黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診及住院部治療的符合納入標準的ACA（+）RSA現妊娠失敗需行清宮術患者16例，在黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診行正常人工流產者15例，共收集蛻膜樣本31例：ACA（+）RSA者蛻膜為試驗組1（n=16）、正常人工流產者蛻膜為對照組1（n=15），其中試驗組1中1例因流產組織發現染色體異常故予以排除。兩組年齡、妊娠時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。納入標準：（1）年齡22～42歲。（2）妊娠12周以內。（3）試驗組1患者符合ACA（+）RSA西醫診斷標準及腎虛血瘀型RSA中醫診斷標準的妊娠失敗患者。根據第8版《婦產科學》［12］修改制定ACA（+）RSA西醫診斷標準：①病史及癥狀：停經12周內，出現陰道少量流血，或伴有腰酸、腹痛等癥狀。②妊娠試驗：血、尿妊娠試驗陽性。③婦科檢查：宮頸口未開，宮體軟，子宮大小與停經周數相符。④超聲檢查：子宮大小、孕囊或胚胎發育與妊娠周數基本相符。⑤流產史：連續發生2次或2次以上自然流產。⑥實驗室檢查：ACA（+）。滿足以上6項方可診斷為ACA（+）RSA。根據《中藥新藥治療先兆流產的臨床研究指導原則》［13］、《中醫婦科學》［14］有關內容結合臨床修改制定腎虛血瘀型RSA中醫診斷標準。主證：孕早期①屢孕屢墮，或如期而墮（墮胎次數≥2次）；②有陰道流血（色暗或夾血塊）；③小腹墜痛；④腰酸。次證：①雙膝酸軟；②頭暈耳鳴；③夜尿頻多。舌脈：舌紫黯或有瘀點，苔薄白，脈細滑或沉澀。上面主證具備①加另外1項或以上，次證具備1項或以上，結合舌脈即可辨為腎虛血瘀型RSA。（4）對照組1為正常妊娠，無自然流產史，有≥1次正常生育史，實驗室檢查ACA（-），要求進行人工流產。（5）自愿接受并配合研究者。試驗組1排除標準：（1）初診經過超聲診斷或者經過觀察后診斷為萄萄胎、異位妊娠等者；（2）夫妻雙方或任意一方染色體異常者；（3）超聲及婦科檢查提示生殖器器質性病變者，如子宮畸形、生殖道畸形、子宮腫瘤等；（4）病毒十項試驗提示巨細胞病毒、弓形蟲病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒感染者；（5）生殖激素測定提示內分泌異常者；（6）男方精液常規異常者；（7）合并心血管、腦血管、肝腎造血系統等嚴重原發性疾病，精神病患者；（8）近期服用其他藥物，致試驗結果難以判斷者。脫落標準：入組后，發現胎兒染色體異常等其他病因造成RSA者。

表1 對照組1和試驗組1年齡、妊娠時間比較（x±s）Table 1 Comparison of age and days of pregnancy between control group 1 and test group 1

1.1.2 選取2015年3月—2016年3月在黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診及住院部治療的符合研究標準的要求行保胎治療的ACA（+）RSA患者11例（試驗組2），在黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診行正常孕檢者13例（對照組2），收集其血清樣本，其中試驗組2中1例自然流產，對照組2中3例自動退出，未計入統計數據。兩組年齡、妊娠時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。納入標準：（1）年齡22～42歲；（2）妊娠6～8周；（3）試驗組2：符合ACA（+）RSA西醫診斷標準及腎虛血瘀型RSA中醫診斷標準者（診斷標準參見1.1.1）；（4）對照組2：正常妊娠于本院門診進行常規產前檢查者；（5）自愿接受并配合研究者。排除標準：同1.1.1。脫落標準：（1）入組后，未按規定劑量服用藥物或自行停藥者；（2）入組后，發現其他造成RSA確切病因者；（3）治療過程中，自行退出或拒絕治療后再次采血者。

表2 對照組2和試驗組2年齡、妊娠時間比較（x±s）Table 2 Comparison of age and days of pregnancy between control group 2 and test group 2

1.2 主要試劑 DEPC原液（廣州市藍博生物技術有限公司）、TRLZOL Reagents（美國Invitrogen公司）、 無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、三氯甲烷（天津市博迪化工有限公司）、異丙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、dNTP（2.5 mmol/L）〔天根生化科技（北京）有限公司）〕、0.1 mol/L DTT（Beye time公司）、OligodT（美國Thermo Scientific公司）、Taq DNA Polymerase（美國 Thermo Scientific 公司）、5× 反轉錄酶 Buffer（美國 Thermo Scientific公司）、10×PCR Buffer （美國 Thermo Scientific 公司）、Rnase Inhabitor （美國 Promega 公司）、M- MLV Reverse Transcriptase（美國 Promega公司）、Human ANXA2 ELISA kit試 劑 盒、Human TLR4 ELISA kit試劑盒。

1.3 主要儀器 電子精密天平（Discovery DV215CD）（美國 OHAUS 公司）、NanoPhotometerTMP -Class 超微量紫外分光光度計（德國 Implen公司）、高速組織勻漿器T1000（德國 IKA公司）、渦旋器（德國 IKA公司）、高速冷凍離心機（美國BECKMANCOULTER公司、型號：Alegra 21R）、羅氏RT-qPCR儀（美國Thermo Scientific 公司）、全自動酶標儀（ELX808）（BioTek Instruments.Inc）、DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）、318W型洗板機（上海三科儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 在冰上提取蛻膜組織RNA，用NanoPhotometerTMP-Class超微量紫外分光光度計測定提取對照組1和試驗組1蛻膜組織RNA純度。記錄RNA濃度后將組織樣品凍存于-80 ℃冰箱。根據美國 Thermo Scientific公司RT-qPCR試劑盒，嚴格按照說明書將RNA反轉錄為cDNA，所得cDNA于-80 ℃保存。然后通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網站進入Genbank數據庫，查找 GAPDH mRNA、 ANXA2 mRNA 以及 TLR4 mRNA 全基因序列，應用上海捷瑞生物工程有限公司設計的引物合成引物序列：ANXA2正向引物為512 3-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-312 3，反向引物為 512 3-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-312 3；TLR4正向引物為512 3-TGCAATGGATCAAGGACCAGAGGC-312 3，反向引物為512 3-GTGCTGGGACACCACAACAATCACC-312 3；內參GAPDH正向引物為512 3-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-312 3，反向引物為512 3-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -312 3。最后采用RT-qPCR 法測定 ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA 水平，使用2x SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒，反應體系：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，總共 50 個循環，72℃延伸30 s。經過兩步法擴增后得出Ct數值，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平。

1.4.2 試驗組2從入組留取血清樣本后即給予補腎活血方，藥物組成：丹參 20 g、菟絲子 15 g、續斷 15 g、桑寄生 15 g、阿膠（烊化）15 g、黃芪15 g，根據患者情況隨證加減，煎藥至300 ml湯劑，早晚分服，治療4周。以上中藥湯劑由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局及煎藥室提供。對照組2不采取任何干預方法。檢測兩組患者治療前及治療后血清孕酮、β人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、ANXA2、TLR4水平。

首先將血清樣本常溫下解凍備用，在酶標板上設置標準品孔5孔，稀釋后濃度分別為240、160、80、40、20 μg/L（Human ANXA2 ELISA kit試劑盒），及 18、12、6、3、1.5 ng/ml（Human TLR4 ELISA kit試劑盒），然后加待測樣品 10 μl，37 ℃溫育30 min；酶標板每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次。然后分別加入50 μl酶標試劑于待測樣品孔中，使之混勻，后重復溫育、洗滌。加入顯色劑 A 50 μl、B 50 μl，混勻、避光。于每孔中加入50 μl終止液，最后于ELX808全自動酶標儀450 nm波長處依序測量各孔OD值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，同組治療前后比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組1和試驗組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比較 對照組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA水平高于試驗組1，TLR4 mRNA水平低于試驗組1，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.2 對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較 治療前對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療后對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。試驗組2治療后血清孕酮、β-HCG、ANXA2水平高于治療前，血清TLR4水平低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

3 討論

RSA是一種常見的妊娠疾病，不僅給患者自身帶來了極大的痛苦和心理壓力，也給家庭及社會帶來不良影響。近年來的研究發現，ACA（+）是導致RSA的常見因素之一，也成為了研究熱點［2-5］。ACA是一種自身免疫性抗體，其可以通過誘導凝血，或影響不同因子損害蛻膜血管內皮細胞，形成血栓傾向，從而使胚胎在發育過程中缺血缺氧，進而導致不良妊娠結局的發生［15］。馮曉玲等［11］研究發現，與正常妊娠者相比，ACA（+）RSA者體內的TLR4/NF-κB炎性通路呈活化狀態，其通路上的炎性因子也有相應變化。其中ANXA2和TLR4是該條通路上與血栓、炎癥相關的因子，所以本研究基于此背景，收集ACA（+）RSA者和正常妊娠者蛻膜、血清，探討ANXA2、TLR4在ACA（+）RSA中的表達以及其與該疾病的關系。

本研究結果顯示，對照組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA水平高于試驗組1，TLR4 mRNA水平低于試驗組1，試驗組2治療前血清ANXA2水平低于對照組2，TLR4水平高于對照組2。提示這種變化可能與ACA（+）存在相關性，發生機制可以從ANXA2、TLR4與血栓形成傾向、前列腺素合成、炎癥、滋養細胞凋亡等角度進行解釋。有動物實驗證實了ANXA2基因敲除的小鼠不能完全清除損傷后所形成的動脈血栓，證明了其對防止血栓形成的積極作用［16-17］。KIM等［18］研究也證明ANXA2能明顯抑制栓塞性腦卒中大鼠模型體內血栓形成。ZHANG等［19］研究發現足月蛻膜感染時，可檢測到TLR4表達于炎性細胞表面。PIERANGELI等［20］研究發現，TLR4可誘導滋養細胞凋亡，促進炎性因子和前列腺素分泌，繼而導致早產。所以，ACA（+）RSA者蛻膜中ANXA2 mRNA水平降低，TLR4 mRNA水平升高，可引起ACA（+）改變，使蛻膜呈現血栓傾向，從而引發流產。

表3 對照組1和試驗組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比較（x ±s）Table 3 Comparison of the expression of ANXA2 mRNA，TLR4 mRNA in decidua tissues between the control group 1 and the test group 1

表4 對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較（x±s）Table 4 Comparison of the expression of progesterone，β-HCG，ANX A2 and TLR4 in blood serum between the control group 2 and the test group 2

ACA（+）RSA與中醫滑胎病之腎虛血瘀證的臨床表現、致病機制等大致相同［21］。瘀血阻滯沖任，新血不能灌注胞宮，使胞宮不能養胎，致墮胎。數次墮胎耗氣傷血，損傷沖任胞宮久病致瘀，瘀血停滯，從而引起反復自然流產的發生。本病血瘀為標，腎虛為本，應用補腎活血之法進行治療［22-25］。本研究結果顯示，ACA（+）RSA者血清中ANXA2水平較治療前升高，而TLR4水平較治療前降低。提示補腎活血方有利于維持妊娠，其機制可能是通過調節ANXA2、TLR4。補腎活血方不僅可以在妊娠期間提高激素水平，還可從抗炎、抗凝等分子基礎上對ACA（+）RSA進行根本治療。既往研究表明，補腎活血方可顯著提高ACA（+）RSA患者孕酮水平，藥物有效率高［26］。補腎活血方以丹參活血調經，養血補血為君藥，菟絲子、續斷、桑寄生補腎安胎共為臣藥，輔以阿膠、黃芪補血益氣，共奏補腎活血安胎之功。藥理學分析發現，補腎活血方的藥物成分可以改善微循環，促進血液流速，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，對抗血栓形成［27］。亦有研究發現補腎活血類中藥可以改善炎性環境，對TLR4/NF-κB炎性通路具有一定調節作用［28］。

綜上所述，ACA（+）RSA的發生可能與ANXA2低表達、TLR4高表達相關，補腎活血方可以通過上調ANXA2、下調TLR4抑制ACA（+）RSA患者血清高凝狀態，改善炎性環境，進而改善妊娠結局。

作者貢獻：馮曉玲、常卓進行文章的構思與設計，撰寫論文，對文章整體負責、監督管理；常卓、張璇進行研究的實施與可行性分析；張璇、趙顏進行數據收集；常卓進行數據整理、統計學處理，對結果進行分析與解釋；常卓、趙小萱進行論文的中文修訂；常卓、王煒進行論文的英文修訂；常卓、陳璐、王煒負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。