高危型人乳頭瘤病毒載量對不同宮頸病變調(diào)節(jié)性T淋巴細胞表達的影響研究

余楊，付艷麗，孫翔

高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及宮頸癌的主要病因［1-4］。發(fā)達國家建立的完善篩查體系，使宮頸癌的發(fā)病率和病死率顯著下降，新發(fā)病例居于全身惡性腫瘤的第10位，而在發(fā)展中國家，新發(fā)病例位于第2位［5］。由此可見，基于HR-HPV建立可進一步分選出高級別CIN和宮頸癌高危人群的合理篩查體系很重要和迫切。腫瘤是多種因素共同作用的結(jié)果，HR-HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，卻非唯一致病條件，HR-HPV感染后誘發(fā)的宮頸病變轉(zhuǎn)歸與機體免疫功能，尤其是宮頸局部微環(huán)境免疫功能密切相關(guān)［6］。機體免疫調(diào)控復(fù)雜多樣，免疫細胞之間，外來抗原HR-HPV和免疫細胞之間，HR-HPV、免疫細胞與局部微環(huán)境之間均存在相互制約、相互調(diào)節(jié)的交互作用和交聯(lián)影響。免疫抑制細胞構(gòu)筑的免疫抑制微環(huán)境通過免疫耐受、免疫逃逸等機制促進宮頸病變的進展［7］，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）是一群發(fā)揮免疫抑制功能的獨特輔助性T淋巴細胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）是Treg的特征性分子標(biāo)志，可對腫瘤免疫應(yīng)答從啟動到效應(yīng)的整個階段全程調(diào)控。本研究同步監(jiān)測宮頸局部微環(huán)境HR-HPV載量和Treg變化，探討其與宮頸病變進程的聯(lián)系和發(fā)展趨勢，為HR-HPV持續(xù)性感染者更深入地分流診治提供臨床依據(jù)。

本研究背景：

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素參與調(diào)控的復(fù)雜過程，僅高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）誘導(dǎo)細胞內(nèi)DNA突變是不夠的，還需在慢性炎癥的持續(xù)刺激下不斷累積變異，再加上微環(huán)境改變腫瘤細胞的生物學(xué)特性，發(fā)生惡性特征轉(zhuǎn)化的強大激活信號，基因組、微環(huán)境、炎癥和免疫體系發(fā)生改變的綜合結(jié)果導(dǎo)致了癌變的風(fēng)險，因此，HR-HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件而非充分條件，基于HR-HPV感染并能方便、無創(chuàng)、準(zhǔn)確量化地反映宮頸癌生物學(xué)行為變化的標(biāo)志物是臨床重點。目前宮頸局部微環(huán)境中HR-HPV載量對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）表達的影響及其兩者同時在HR-HPV免疫逃逸和宮頸病變進程中相互作用的報道較少。本研究圍繞HR-HPV抗原既可激發(fā)免疫反應(yīng)又可負向抑制免疫反應(yīng)的特點，探討不同微環(huán)境誘導(dǎo)的Treg表達差異對宮頸病變進程或促進或抑制的雙向影響，為宮頸癌前病變以及宮頸癌個性化診療方案提供實驗指導(dǎo)和臨床思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2015年7月河南理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)液基薄層細胞檢測技術(shù)（TCT）篩查、HR-HPV基因分型檢測〔聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）-反向點雜交法〕，最終經(jīng)陰道鏡下宮頸多點病理活檢確診的HR-HPV持續(xù)性感染的不同宮頸病變患者342例，年齡38～55歲；其中慢性宮頸炎55例、CINⅠ級73例、CINⅡ級71例、CINⅢ級72例、宮頸癌71例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有1年以上性生活史；（2）經(jīng)2名以上有經(jīng)驗病理科醫(yī)師確診；（3）患者本人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期婦女；（2）合并其他惡性腫瘤或自身免疫性疾病；（3）近期使用過免疫抑制類藥物；（4）人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性；（5）有放化療史；（6）2周內(nèi)接受過局部或全身抗病毒藥物治療。HR-HPV持續(xù)性感染的定義：HR-HPV感染者隨訪1次/6個月，在間隔6～12個月相鄰兩次隨訪中，同一例患者宮頸檢測樣本均顯示HR-HPV陽性且為同種類型，修改為第1年隨訪1次/4個月，以后至少1次/6個月（依據(jù)病情動態(tài)監(jiān)測），持續(xù)時間均在2年以上［8-9］。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀購自美國BD FACS Calibur，配有BD CellQuest軟件。試劑：鼠抗人異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4單克隆抗體、鼠抗人PE-CD25單克隆抗體、鼠抗人PE-Cy5-Foxp3單克隆抗體均購自美國eBioscience公司。PCR擴增儀DA7600型和HRHPV核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58共8個型）檢測試劑盒均由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 采用宮頸刷取物制備宮頸病變單細胞懸液 采用陰道窺器暴露宮頸，干棉球拭凈宮頸口過多分泌物，觀察宮頸，將刷頭插入宮頸管，中央較長的刷絲針對準(zhǔn)新鮮病變部位，順時針或逆時針旋轉(zhuǎn)3～5圈，取下刷頭，并將其浸泡在含液基細胞學(xué)保存液的瓶中，300目尼龍網(wǎng)過濾雜質(zhì)，取10 ml保存液轉(zhuǎn)入15 ml試管，402×g離心5 min，棄上清液，取2 ml沉淀液，以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2～3次，45×g離心沉淀1～2 min，進行細胞計數(shù)，不少于106個。

1.3.2 流式細胞儀檢測單細胞懸液中Treg 調(diào)整細胞濃度至（1～2）×107個/ml，用PBS洗滌、重懸，取上述細胞100 μl，加入鼠抗人FITC-CD4單克隆抗體、鼠抗人PE-CD25單克隆抗體各5 μl，混勻，室溫避光20 min，加冷固定破膜劑1 ml，4 ℃避光孵育30 min，加破膜緩沖液2 ml，洗滌2次，棄上清液，加鼠抗人PE-Cy5-Foxp3單克隆抗體進行細胞內(nèi)染色，4 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。用空白管調(diào)節(jié)電壓，以CD25同型對照調(diào)節(jié)補償，確定細胞群，再以細胞設(shè)門，以Foxp3同型對照確定陽性信號，最后測定C管，檢測Foxp3+細胞占C細胞的百分比。

1.3.3 HR-HPV載量檢測 無菌條件下采用宮頸刷插入宮頸內(nèi)，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈后停留片刻取出，將宮頸刷置入無菌管，采集的宮頸分泌物及時送檢或4 ℃保存1周內(nèi)檢測。DNA提取和PCR擴增按其說明書（PCR熒光法）進行具體操作。根據(jù)HR-HPV載量拷貝數(shù)分為4組：低載量組（104～105copies/ml）69例、中載量組（＞105～106copies/ml）90例、高載量組（＞106～107copies/ml）106例、超高載量組（＞107copies/ml）77例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以M（P25，P75）表示，HR-HPV載量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換，多組間比較采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson簡單相關(guān)分析及偏相關(guān)分析；選用簡單和復(fù)式箱型圖解析數(shù)據(jù)分布，繪制散點圖加趨勢擬合線描述線性關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 繪制HR-HPV載量標(biāo)準(zhǔn)曲線 PCR熒光法閾值設(shè)定原則是值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點，且循環(huán)閾值（Ct）不出現(xiàn)任何數(shù)值。以標(biāo)準(zhǔn)品4個濃度（1×103～1×106copies/ml）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。Ct與樣本起始模板的拷貝數(shù)呈正相關(guān)，與起始模板拷貝數(shù)對數(shù)值間有嚴(yán)格的線性反比關(guān)系。

圖1 PCR熒光法檢測HR-HPV載量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of HR-HPV load detected by QF-PCR

2.2 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡及Treg比較 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg較低載量組升高，高載量組、超高載量組患者Treg較中載量組升高，超高載量組患者Treg較高載量組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。復(fù)式箱型圖顯示各組均無異常值，HR-HPV載量逐步增加，Treg分布愈加分散，超高載量組Treg分布最分散，低、中載量組Treg分布較為集中（見圖2）。

2.3 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡、Treg及HR-HPV載量比較 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中CINⅠ級患者Treg較慢性宮頸炎升高，CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量較慢性宮頸炎、CINⅠ級升高，CINⅢ級患者Treg較CINⅡ級升高，宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量較CINⅡ級、CINⅢ級升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。復(fù)式箱型圖顯示在慢性宮頸炎中有1個溫和的異常值，其余病變組無異常值，隨宮頸病變程度的加重，Treg分布愈加分散，宮頸癌組Treg分布最分散，低宮頸病變Treg分布較為集中（見圖3）；在慢性宮頸炎和宮頸癌中共有3個溫和的異常值，其余病變組無異常值，隨宮頸病變程度的加重，HR-HPV載量分布趨向分散，宮頸癌組HRHPV載量分布最分散，低宮頸病變HR-HPV載量分布較為集中（見圖4）。

表1 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡及Treg比較〔M（P25，P75）〕Table 1 Comparison of age and number of Treg in patients with different cervical lesions by HR-HPV load

圖2 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg分布Figure 2 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by HR-HPV load

2.4 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者分布 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組宮頸病變分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。復(fù)式箱型圖顯示，在低、中載量組不同宮頸病變的Treg分布較為集中，高、超高載量組不同宮頸病變的Treg分布更加分散，特別是宮頸癌組數(shù)值波動幅度較大；低級別宮頸病變不同載量組中Treg集中分布趨勢明顯，僅CINⅠ級在高載量組有小幅波動，高級別CIN和宮頸癌在低、中載量組Treg分布較為集中，在高、超高載量組數(shù)據(jù)分散，波動明顯，幅度較大（見圖5）。

2.5 相關(guān)性分析 簡單相關(guān)分析顯示，HR-HPV載量與宮頸病變、Treg呈正相關(guān)（r=0.631、0.683，P＜0.05），組別與宮頸病變、Treg呈正相關(guān)（r=0.612、0.686，P＜0.05），宮頸病變與Treg呈正相關(guān)（r=0.863，P＜0.05）。控制組別后，偏相關(guān)分析顯示，HR-HPV載量與宮頸病變、Treg呈正相關(guān)（r=0.204、0.137，P＜0.05）， 宮 頸 病 變 與 Treg呈 正 相 關(guān)（r=0.770，P＜0.05）。控制Treg后，偏相關(guān)分析顯示，宮頸病變與HR-HPV載量呈正相關(guān)（r=0.114，P＜0.05），組別與宮頸病變無直線相關(guān)關(guān)系（r=0.053，P＞0.05）。以組別為橫坐標(biāo)，Treg為縱坐標(biāo)，宮頸病變作為點標(biāo)簽繪制散點圖并添加總體趨勢擬合線（R2=0.572），結(jié)果顯示，此三變量之間存在線性關(guān)系，子變量慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌的趨勢擬合線決定系數(shù)R2依次為0.559、0.339、0.653、0.546、0.085。不同宮頸病變與HR-HPV載量、Treg的擬合線決定系數(shù)R2分別為0.399和0.789（見圖6）。

表2 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡、Treg及HR-HPV載量比較〔M（P25，P75）〕Table 2 Comparison of age，number of Treg and HR-HPV load in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

圖3 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg分布Figure 3 Distribution of the number of Treg in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

3 討論

圖4 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者HR-HPV載量分布Figure 4 Distribution of the level of HR-HPV load in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

表3 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者分布Table 3 Distribution of different cervical lesions in patients by the level of HR-HPV load

宮頸病變階梯式緩慢演變進程，加之病因明確、方便取材的優(yōu)勢，預(yù)示著宮頸癌是可以早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療的，但事實并不似預(yù)期，我國每年新發(fā)宮頸癌患者多達13萬，發(fā)病年輕化趨勢明顯，10年間下降約5歲［10］。化療、手術(shù)和放射等傳統(tǒng)療法難以根治殘留的小病灶或微轉(zhuǎn)移灶，35%左右的患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡［11］，以激活抗腫瘤免疫為基礎(chǔ)的免疫治療，其臨床療效并不理想，這與腫瘤細胞所處的腫瘤微環(huán)境關(guān)系密切［12］，主要是免疫抑制微環(huán)境負向調(diào)控作用的強大。很多病變的早期，機體的全身免疫功能并未出現(xiàn)明顯的改變，但病變局部即已存在免疫抑制。文獻報道，Treg表達強度與HPV-16基因所致宮頸癌變關(guān)系密切［13］。本研究結(jié)果顯示，HR-HPV載量在宮頸癌變期有相對較大的浮動，在慢性宮頸炎/CINⅠ級之間以及CINⅡ級/CINⅢ級之間HR-HPV載量差異不明顯，提示HRHPV載量與宮頸病變的嚴(yán)重程度不總是同步的，一定范圍內(nèi)HR-HPV載量越高，觸發(fā)的抗HR-HPV免疫應(yīng)答越強，適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答有利于HR-HPV清除，但過度的免疫應(yīng)答反過來損壞免疫功能和靶向組織器官功能，使機體處于HR-HPV感染和免疫功能受損的惡性循環(huán)中。HR-HPV載量不能作為區(qū)分宮頸病變程度良好的量化指標(biāo)，但高/超高的HR-HPV載量仍有預(yù)警作用，可間接反映機體對病毒的清除能力和感染輕重。相關(guān)分析顯示，HR-HPV載量、宮頸病變、Treg均呈正相關(guān)，宮頸病變與Treg高度相關(guān)；偏相關(guān)分析顯示：控制組別后，宮頸病變與Treg仍呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)較簡單相關(guān)分析稍微下降；控制Treg后，宮頸病變與組別間不再有直線相關(guān)性。提示HR-HPV載量、Treg、宮頸病變3個變量之間存在交互影響，Treg較HR-HPV載量與宮頸病變進展更具相關(guān)性，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸病變進展惡化過程中必要條件的第一步，宮頸局部微環(huán)境免疫失衡是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，推測病變進展到重度CIN和宮頸癌程度后，細胞的惡性轉(zhuǎn)化可能不再依賴HR-HPV的高載量。

圖5 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者Treg分布Figure 5 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by the level of HR-HPV load

圖6 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者Treg分布Figure 6 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by the level of HR-HPV load

HR-HPV感染不是全身的，不形成病毒血癥。腫瘤微環(huán)境是有別于人體正常內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜系統(tǒng)，具有低氧、低pH值及高壓的特點，使效應(yīng)T淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o功能狀態(tài)，隨后凋亡，從而損害抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中至關(guān)重要［14］。腫瘤微環(huán)境具有異質(zhì)性，不同的個體、不同的腫瘤，甚至在同一個體的不同部位，均面對不同的免疫微環(huán)境，腫瘤免疫治療的療效存在明顯的個體差異，目前多將此歸于腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同HR-HPV載量組別和不同宮頸病變患者Treg均有明顯差異，在超高的病毒載量作用下和宮頸癌變期，Treg分散趨勢明顯，波動明顯，幅度較大，提示HR-HPV載量越高、宮頸病變越重，宮頸局部免疫抑制微環(huán)境組成的異質(zhì)性越顯著，個體差異越大，治療方面應(yīng)突出個性化的特點；復(fù)式箱型圖直觀地顯示了HR-HPV誘導(dǎo)的Treg表達強度在增加宮頸病變這一變量后數(shù)值分布的多樣性，提示宮頸局部免疫抑制微環(huán)境異質(zhì)性的復(fù)雜多變，組成上和功能上的異質(zhì)性，為此在注重個體化治療的同時，密切監(jiān)測微環(huán)境的動態(tài)變化，及時調(diào)整，至關(guān)重要；在判定HR-HPV載量與Treg的相關(guān)性上，若將宮頸病變視為整體考量，其所起的決定作用為0.572，慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌所起的決定作用依次為0.559、0.339、0.653、0.546、0.085，換言之，宮頸癌變期宮頸局部免疫抑制微環(huán)境異質(zhì)性最復(fù)雜。通過上述統(tǒng)計學(xué)分析推測，宮頸癌變期和超高的病毒載量在宮頸局部免疫抑制微環(huán)境異質(zhì)性上發(fā)揮了更大和更為復(fù)雜的作用，在不同程度宮頸病變、不同HR-HPV載量中Treg表達量及其發(fā)揮的功能并由此產(chǎn)生的重要作用并不相同。Treg的免疫抑制作用在HR-HPV相關(guān)性宮頸病變的進程變化中，可能因微環(huán)境的差異具有雙向性調(diào)節(jié)：（1）對HPV誘導(dǎo)的持續(xù)炎性刺激形成保護性生理防御反應(yīng)，在防止過強的免疫損傷和清除病原體之間維持平衡，以減緩組織病理損害；（2）免疫逃逸導(dǎo)致機體對腫瘤的免疫無應(yīng)答或免疫反應(yīng)低下，促使宮頸癌變。結(jié)合本研究結(jié)果，Treg在程度較低的宮頸病變和低拷貝的病毒載量時，作用較一致，其表達水平的升高更多是一種應(yīng)激性保護防御反應(yīng)的正向作用，提示Treg在病毒感染過程中可使組織損傷程度最小化［16］，致使HR-HPV感染雖持續(xù)存在，但患者病情較輕，應(yīng)動態(tài)監(jiān)護，持續(xù)隨訪。Treg在CINⅢ級/宮頸癌和高/超高拷貝的病毒載量時，三者之間不一致性更大，表現(xiàn)多樣，復(fù)雜多變。

在HR-HPV相關(guān)性宮頸病變中，細胞免疫功能狀態(tài)雖不能直接反映抗HR-HPV免疫效應(yīng)，通過聯(lián)合HR-HPV載量等指標(biāo)能較好地預(yù)測HR-HPV感染人群的宮頸病變發(fā)展進程。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅依賴于基因突變，還與腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性有關(guān)，所有抗瘤和促瘤因素共同組成腫瘤微環(huán)境的免疫網(wǎng)絡(luò)，腫瘤微環(huán)境的動態(tài)改變影響抗瘤/促瘤效應(yīng)平衡，決定腫瘤逆轉(zhuǎn)、穩(wěn)定和惡化的轉(zhuǎn)歸趨向。CD4+Treg負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特性，不僅導(dǎo)致HR-HPV慢性感染長時間持續(xù)存在，所形成的慢性炎性微環(huán)境作為免疫微環(huán)境的重要組成部分，在宮頸病變進展過程中作用重大，通過其異質(zhì)性和動態(tài)演變精細調(diào)控病毒復(fù)制和機體效應(yīng)之間的相互作用。因此，基于對HR-HPV感染引發(fā)人體病變的整體認(rèn)識，從宮頸局部微環(huán)境入手，兼顧正向和負向調(diào)控機制，此外，考慮到腫瘤免疫抑制性微環(huán)境存在的異質(zhì)性，在宮頸癌免疫診斷和治療方面應(yīng)體現(xiàn)個體化特點，助推精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展。

作者貢獻：余楊進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；孫翔進行數(shù)據(jù)收集、整理，統(tǒng)計學(xué)處理；付艷麗進行論文的修訂，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；余楊、付艷麗對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。