大孔樹脂法對(duì)益陰消渴滴丸的純化工藝研究

陳 利 ，宋國(guó)紅 ，李 卿

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院江南分院藥學(xué)部，重慶 400010； 2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

益陰消渴原劑型為膠囊劑，功能主治為益氣養(yǎng)陰、清熱生津，用于氣陰不足所致消渴，以及2型糖尿病見上述證候者[1]，作用明確，成分清楚。處方中君藥葛根所含葛根素不僅具有較好的降血糖作用，同時(shí)還具有改善糖尿病并發(fā)癥的藥理活性。研究表明，葛根素能改善胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠血糖和保護(hù)其腎臟功能。處方中其余3味中藥也具有較好的降血糖作用。由于原制劑生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，采用部分藥物粉碎后直接入藥的方式，其余藥材水煎煮入藥，導(dǎo)致葛根素溶出受限，影響臨床療效。本研究中采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法優(yōu)選了益陰消渴處方提取工藝，選用大孔樹脂柱層析法對(duì)處方中的有效部位群進(jìn)行了富集純化，以處方君藥葛根中主要成分葛根素為測(cè)評(píng)指標(biāo)，優(yōu)化益陰消渴方的分離純化工藝，為后續(xù)的制劑成型提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB－5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH－S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

葛根、野苦瓜、荔枝核、山藥藥材均購(gòu)自重慶市菜園壩中藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員分別鑒定為豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth.的干燥根、葫蘆科植物野苦瓜 Momordica charantia L.的成熟果、無患子科植物荔枝 Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子、薯蕷科植物薯蕷 Dioscorea opposite Thunb.的干燥根莖；D101型大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為752－200108）；甲醇為色譜純，水為一級(jí)水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －水（28∶72）；流速：1 mL ／min；柱溫：30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。選擇葛根素含量為檢測(cè)指標(biāo)，按2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]葛根藥材含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果可見，葛根素峰與相鄰峰分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取葛根素對(duì)照品18.64 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。

照益陰消渴處方比例，稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第 1次回流 1.5 h，第 2次、3次回流 1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，加水適量使溶解，靜置，取上清液過D101型大孔樹脂，棄去過柱液，用水洗至近無色，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，于水浴上分別濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，作為供試品，并制備供試品溶液。

照益陰消渴處方比例，稱取缺葛根的其余3味藥材，照供試品的提取方法，制得缺葛根陰性樣品，并制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液0.5，1，2，4，5 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 μL，進(jìn)樣，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以葛根素進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝7 131 295 X－34 632，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在0.372 8～3.728 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品貯備溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，8，16 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD 為 0.94% （n＝6），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定葛根素峰面積，計(jì)算其含量。結(jié)果的 RSD為1.06%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一樣品6份，精密加入葛根素對(duì)照品適量，照2.2項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定葛根素峰面積，計(jì)算其含量及回收率。結(jié)果見表1。

2.2 富集純化工藝考察

2.2.1 大孔樹脂乙醇洗脫用量考察

按處方比例，稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用6倍量70%乙醇回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇至無醇味，加10倍量水使溶解，靜置，取上清液過D101型大孔樹脂，棄去過柱液，用水洗至近無色，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，每次20 mL，收集8次，于水浴上分別濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果見圖2。可見，以70% 乙醇洗脫時(shí)，葛根素集中于2～3倍洗脫量，其固形物質(zhì)量、葛根素含量85%以上均集中在此部分。故在吸附樣品后，加水洗脫至近無色，再用70%乙醇（用藥材量的8倍量）洗脫時(shí)，即可。

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 乙醇洗脫解吸曲線

2.2.2 大孔樹脂用量考察

按處方比例，稱取野苦瓜25 g，葛根155 g，荔枝核10 g，山藥10 g，用6倍量70%乙醇回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇至無醇味，加10倍量水使溶解，靜置，取上清液并溶解至2 000 mL，備用。

分別取5根玻璃柱（直徑為1 cm），稱取大孔樹脂17.5 g（相當(dāng)于干樹脂 5 g），分別取上述溶液 20 mL（相當(dāng)于 2 g 藥材）、30 mL（相當(dāng)于 3 g 藥材）、50 mL（相當(dāng)于5 g 藥材）、100 mL（相當(dāng)于 10 g 藥材）、200 mL（相當(dāng)于20 g藥材），過D101型大孔樹脂，分別用藥材量的25倍量水洗滌，收集過柱液和水洗液，再用藥材8倍量的70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，分別于水浴上濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，計(jì)算葛根素含量，公式如下。結(jié)果見表2。可見，綜合分析后選用3 g藥材、5 g樹脂，即藥材量 － 樹脂量（0.6 ∶1）。

2.2.3 大孔樹脂徑高比考察

按處方比例稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取，提取液均分為3等份，備用；取徑高比為 1 ∶3.4，1 ∶5，1 ∶7 的樹脂柱，各加入已處理好的 D101型大孔樹脂 8 g（濕法裝柱）。將藥材提取液分別上柱，待上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，分別于水浴上濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果徑高比為1 ∶3.4，1 ∶5，1 ∶7 時(shí) 葛 根素含 量分別 為 0.28% ，0.26%，0.25%。經(jīng) D101大孔樹脂處理，樹脂徑高比為1∶3.4效果更優(yōu)。

表2 不同量益陰消渴提取液對(duì)吸附純度效果的影響

2.2.4 藥液上樣質(zhì)量濃度考察

按處方比例稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取，回收乙醇，加10倍量水使溶解，取上清液均分為3等份，備用；溶液1為每1 mL相當(dāng)于0.04 g藥材的溶液，溶液2濃縮至每1 mL相當(dāng)于0.4 g藥材的溶液，溶液3濃縮至每1 mL相當(dāng)于0.8 g藥材的溶液，備用。取徑高比為1∶3.4的樹脂柱，加已處理好的D101型大孔樹脂9 g（濕法裝柱）。將藥材提取液分別上柱，上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于水浴上蒸干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果上樣濃度為 1 ∶0.04，1 ∶0.4，1 ∶0.8 時(shí)葛根素含量分別為 0.28% ，0.24% ，0.22% 。以藥材提取液上樣（0.04 g／mL）過 D101大孔樹脂處理，葛根素保留吸附率較好。故確定用藥材10倍量水溶解后，取上清液過柱。

2.2.5 藥液 pH 考察

按處方比例稱取稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取、回收乙醇，加水溶解，取上清液均分為4等份，備用。溶液1為原液；溶液2和溶液3用5%碳酸氫鈉溶液分別調(diào)pH為8和9；溶液4用5%鹽酸溶液調(diào)pH為6，備用。取徑高比為1∶3.4的樹脂柱，加已處理好的D101型大孔樹脂（濕法裝柱），將各供試溶液分別上柱，待上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，水浴蒸干，減壓干燥，稱定固形物質(zhì)量，測(cè)定葛根素含量。結(jié)果溶液4，2，3的葛根素含量分別為 0.25% ，0.25% ，0.24% ；溶液 1 含量為0.28%。表明測(cè)得樣品中葛根素的含量，用5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 8和pH 9及用5%鹽酸溶液調(diào)pH 6的溶液均低于原液（即不調(diào)節(jié)pH），故藥材提取回收乙醇后，加水溶解不需調(diào)pH即可過大孔樹脂柱。

2.2.6 吸附流速和洗脫流速考察

關(guān)于吸附流速和洗脫流速，由于樹脂粒徑小，即使全部放開其速度也是很慢，屠鵬飛等[2]的研究也證明了這一點(diǎn)，并指出吸附流速和洗脫流速對(duì)目標(biāo)成分的收率和含量基本無影響，故建議吸附流速采用全流速的1／2，洗脫流速采用全流速。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)擬訂的提取方法，稱取野苦瓜20 g、葛根124 g、荔枝核8 g、山藥8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2，3次回流1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，加10倍量水使溶解，照前述確定的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行大孔樹脂吸附－洗脫試驗(yàn)，上柱前溶液和乙醇洗脫液分別用高效液相色譜法測(cè)定葛根素含量。結(jié)果見表3。可見，葛根素的收率與前面的吸附試驗(yàn)和樹脂載量試驗(yàn)的葛根素收率基本吻合，葛根素轉(zhuǎn)移率達(dá)85.14%，證明工藝可行。

表3 純化效果驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%）

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)選擇

本試驗(yàn)中以葛根素含量為檢測(cè)指標(biāo)，考察了乙醇洗脫用量、大孔樹脂用量、樹脂徑高比、藥液上樣濃度、藥液pH對(duì)益陰消渴方有效部位群富集純化的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用大孔樹脂分離純化后的處方固形物質(zhì)量大為減少，以葛根素為代表的有效部位群純度增長(zhǎng)顯著，通過減少固形物質(zhì)量，而處方有效部位群相對(duì)穩(wěn)定，為后續(xù)制備新型速釋制劑打下了良好的基礎(chǔ)。

3.2 大孔樹脂吸附分離技術(shù)優(yōu)勢(shì)比較

與傳統(tǒng)的分離純化方法相比[3]，采用大孔樹脂吸附分離技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行精制，從中提取有效部位（群）或有效成分（群），有明顯優(yōu)勢(shì)。據(jù)報(bào)道，用樹脂對(duì)苷類[4]、黃酮[5]、萜類[6]、生物堿[7]、內(nèi)酯[8]、有機(jī)酸[9]等的分離純化效果較好。本研究中篩選了不同型號(hào)的大孔樹脂用于本處方的分離純化試驗(yàn)。結(jié)果表明，D101型大孔樹脂適用范圍較廣，對(duì)于非極性或弱極性的有機(jī)化合物普遍吸附能力強(qiáng)，特別是對(duì)皂苷類的分離、純化效果尤佳，對(duì)黃酮類化合物也適宜[10－13]。處方中野苦瓜主要化學(xué)成分包括三萜、甾類、生物堿等；葛根化學(xué)成分包括黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、葛酚苷類等，其中異黃酮類為其主要有效成分，異黃酮類化合物有葛根素、大豆素、大豆苷等，葛根素為其主要成分；荔枝核含皂苷。D101型大孔樹脂經(jīng)20多年的生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，該產(chǎn)品植物水溶性物質(zhì)分離、純化行之有效，工藝簡(jiǎn)單，易于操作，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，成本較低，安全可靠，故選用D101型大孔樹脂對(duì)該方劑進(jìn)行制備工藝的研究。

3.3 展望

益陰消渴原制劑為部分葛根藥材粉碎入藥，因而葛根中主要成分葛根素溶出較慢[14－15]，在人體內(nèi)吸收和利用較差。前期研究報(bào)道了采用單因素影響試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法優(yōu)化處方提取工藝各項(xiàng)參數(shù)，在后續(xù)試驗(yàn)過程中，選用大孔樹脂法對(duì)益陰消渴處方的有效部位群進(jìn)行了富集、純化，實(shí)現(xiàn)了中間提取物收率減少和日服用量降低的目標(biāo)，可加快藥物中有效成分溶出的速度，提高生物利用度，為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。