正交試驗優化逆萎康的水提工藝

曹淑君 ，王輝明 ，劉洪玲 ，張翠萍 ，凌 勇 ，孫向紅 ，

（1.青島大學藥學院，山東 青島 266021； 2.青島大學附屬醫院，山東 青島 266555）

近年來，慢性萎縮性胃炎發病率逐漸升高，且有發展成為癌癥的可能[1－2]。逆萎康為醫院制劑，用于治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生、不典型增生等癌前病變用藥，是具有明確作用的協定處方[3]，具有補脾益氣、健胃止痛、清熱解毒的療效，臨床應用多年，療效顯著[4]。方中雪膽為君藥，功能清熱解毒、消腫止痛，可用于治療胃十二指腸潰瘍、胃痛，因此選擇雪膽總皂苷為指標[5]；黃芪為臣藥，具有補脾益氣功能，同時現代藥理研究表明其主要的活性成分為黃芪甲苷，故選擇黃芪甲苷為指標[6－7]。本研究通過正交試驗，并以雪膽總皂苷、黃芪甲苷為指標，優選出逆萎康的最佳水提工藝，為醫院申報顆粒制劑提供可行性的研究資料。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius BP 211D型電子天平（德國 Sartorius公司）；TU－190型紫外－可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥

齊墩果酸對照品（批號為 110709－200505，純度100%），黃芪甲苷對照品（批號為110781－201616，純度為97.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，德國默克公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純；雪膽 Hemsleya amabilis Diels，黃芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bunge，老龍皮 Lobaria retigera Trevis，朱砂七 Antenoron filiforme，半枝蓮 Scutellaria barbata D.Don，海螵蛸 Sepia esculenta Hoyle，陳皮 Citrus reticulata Blanco，生姜 Zingiber officinale Roscoe，均購于青島善大天源中藥飲片有限公司，并由青島大學附屬醫院藥劑科孫向紅教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 雪膽總皂苷含量測定[2－3]

2.1.1 溶液制備

按處方量稱取藥材，加水浸泡、煎煮，濃縮至200 mL,得提取液，備用。精密吸取1 mL樣品提取液，置100 mL容量瓶中，依次加入石油醚脫脂、正丁醇萃取后，待正丁醇萃取液揮干溶劑后，加適量甲醇溶解，定容，作為供試品溶液。取齊墩果酸對照品46.625 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇溶解，超聲處理，在用甲醇稀釋至刻度，作為對照品貯備液（質量濃度為 1.865 g／L），精密吸取該溶液 1.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液（質量濃度0.074 6 g ／L）。按處方量稱取藥材（雪膽除外），加水浸泡、煎煮，濃縮至200 mL，備用。精密吸取1 mL提取液，依次加入石油醚脫脂、正丁醇萃取后，待正丁醇萃取液揮干溶劑后，加適量甲醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，作為陰性對照品溶液。

2.1.2 測定波長確定

取對照品、供試品、陰性對照品溶液在200～600 nm波長范圍內進行紫外吸收光譜掃描。結果顯示，對照品、供試品溶液均在549 nm波長處有最大吸收峰且峰形一致，而陰性對照品在此波長處無吸收，故選擇549 nm作為樣品測定的波長。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取對照品溶液 0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0 mL，置具塞試管中，水浴中揮干甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛－冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸1.0 mL，加塞搖勻，于60℃水浴中加熱15 min后，冷卻至室溫，向試管中精密加入10 mL冰醋酸，搖勻于549 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標、齊墩果酸質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標繪制標準曲線，計算得線性回歸方程 Y＝0.041 03 X－0.012 92，r＝0.999 0（n＝6）。結果表明，齊墩果酸質量濃度在1.286 ～11.134 μg／mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：取對照品溶液連續進樣6次，每次0.8 mL。結果吸光度的 RSD 為 1.45% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一逆萎康湯貯備液6份，依法制備供試品溶液，測定吸光度。結果雪膽總皂苷的平均含量為0.262 g／L，RSD 為 2.31% （n ＝6），表明方法重復性好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，分別放置0，1，2，4，6，8 h時測定吸光度。結果的 RSD 為 3.31% （n＝6），表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品溶液（雪膽總皂苷質量濃度為 0.262 g／L），共取 9 份，每份 25 mL，分別加對照品溶液（質量濃度為 1.865 g ／L）1，2，3 mL，各3份，依法制備供試品溶液，在549 nm波長處測定吸光度。結果見表1。

2.2 黃芪甲苷含量測定[4]

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Sapphire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈 －水（32 ∶68，V／V）；流速：1.0 mg／mL；柱溫：28 ℃；氮氣壓力：360 kPa，蒸發溫度：40 ℃，增益 6。理論板數以黃芪甲苷峰計算不低于6 000。色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

按處方量稱取黃芪藥材，加水浸泡、煎煮，濃縮至200 mL，備用。精密吸取提取液5 mL，加水稀釋至10 mL，用水飽和的正丁醇提取5次（每次60 mL），合并正丁醇，用氨試液充分洗滌3次（每次60 mL），棄去氨液，正丁醇飽和水溶液洗滌2次（每次60 mL），分取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。取黃芪甲苷對照品3.02 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得對照品貯備液（質量濃度為 0.302 g ／L）。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）

圖1 高效液相色譜圖

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：取黃芪甲苷對照品貯備液，分別精密進樣 2.5，5.0，7.5，10.0，15.0，20.0 μL，按擬訂色譜條件測定黃芪甲苷峰面積，以峰面積積分值自然對數為縱坐標（Y）、進樣量的自然對數為橫坐標（X）繪制標曲線，得回歸方程 Y＝0.9905X＋11.189，r＝0.9963（n＝6）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在 0.755 ～ 6.04 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取黃芪甲苷對照品溶液連續進樣6次，每次 10 μL，測定峰面積。結果的 RSD 為 1.063%（n＝6），表明儀器精密度好。

重復性試驗：取同一逆萎康湯貯備溶液6份，依法制備供試品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，按擬訂色譜條件測定黃芪甲苷含量。結果貯備藥液中黃芪甲苷平均含量 0.370 g／L，RSD 為 2.06% （n ＝6），表明方法重復性好。

穩定性試驗：取供試品適量，依法配制，分別放置0，1，2，4，6 ，8 h 時測定峰面積。結果的 RSD 為 2.85%（n＝6），表明供試品溶液8 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品貯備液（黃芪甲苷質量濃度為 0.034 963 g／L），共取 9 份，每份 2.5 mL，分別加對照品溶液（質量濃度為 0.302 g ／L）1，2，3 mL各3份，依法制備供試品溶液，進樣 10 μL，測定峰面積。結果見表1。

2.3 水提工藝優選

2.3.1 因素水平表

采用正交設計試驗優化逆萎康的水提工藝，并以雪膽總皂苷、黃芪甲苷為指標，考察煎煮次數（因素A）、提取時間（因素B）和固液比（因素C）3個因素對提取效果的影響，按 L9（34）正交表設計進行試驗。因素水平見表2。

表 2 L9（34）正交試驗因素水平

2.3.2 正交試驗設計與結果

按處方量精密稱定各藥材，按正交設計下9組試驗條件進行煎煮，過濾、濃縮、離心，制得9份正交試驗樣品，依法測定雪膽總皂苷和黃芪甲苷的含量。結果見表3。

表3 正交試驗結果

2.3.3 方差分析

黃芪甲苷、雪膽總皂苷方差分析結果見表4。從水提工藝黃芪甲苷方差分析結果可見，因素A和B的差異具有顯著性，而C因素不具有顯著性。從水提工藝的直觀分析表可見，極差大小順序為A＞B＞C，所得影響因素的大小順序為A＞B＞C。雪膽總皂苷方差分析表可見，因素A的差異是具有顯著性的，而其余兩個因素B和C因素的差異不具有顯著性。從水提工藝的直觀分析表可見，極差大小順序為B＞C＞A，所得影響因素的大小順序為B＞C＞A。故確定最佳提取工藝為A2B1C3，即提取2次，提取1 h，固液比為12倍。

表4 方差分析結果

2.3.4 最佳工藝驗證試驗

為驗證該工藝的準確性，按處方劑量3份，分別按最佳工藝條件進行操作、測定。結果樣品中雪膽總皂苷為 1.425 mg／g，RSD 為 2.63% （n ＝3）；黃芪甲苷的含量為 4.112 mg／g，RSD 為 1.83%（n ＝3）。

3 討論

目前，中醫治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究取得了較好的成果，中醫治療慢性萎縮性胃炎具有優勢[8－9]。逆萎康湯由8味中藥組方，成分復雜，各藥材有其獨立而協作的作用。由于臨床長期以來采用湯劑給藥方式，遵循傳統中醫用藥的習慣和有效降低生產成本。在保持本方原有療效的基礎上，本研究中結合現代化藥物制劑技術將湯劑研制成攜帶和服用方便、生物利用度高的顆粒劑，具有較好的實際意義。

現代藥理研究表明，雪膽水煎液及總皂苷具有鎮痛、抗炎及抗內毒素作用，使其祛瘀止痛的功效得到了證實[10－11]；黃芪中的黃芪甲苷具有抗病毒、降血糖、增強人體免疫等活性，廣泛用于臨床[12]。因此，選擇這2種主要藥效成分的含量用作為優選化逆萎康口服制劑提取工藝的指標。

本研究中根據藥材性質來選擇以水提方式，同時采用正交試驗優化其提取工藝，進一步提高藥材中的有效含量。由于正交試驗可合理安排，減少次數，因此是一種高效、經濟的方法[13－14]。既保留了原方的特點和優勢，又能高效、充分地提取藥材的有效成分，符合醫院制劑實際配制情況[15]。在傳統水煎法基礎上，選擇的3個因素對提取工藝有不同的影響，最終選擇雪膽總皂苷和黃芪甲苷作為主要指標，通過正交試驗進一步優化提取工藝。結果優選出最佳水提條件，即提取2次，提取1 h，固液比為12倍，按最佳工藝進行驗證試驗，穩定性好，有效成分含量高。

由于中藥復方制劑成分比較復雜，只考察了君藥雪膽的主要有效成分雪膽總皂苷及臣藥黃芪的主要有效成分黃芪甲苷，而未對其他有效成分進行檢測，還需進一步的研究優選逆萎康口服制劑最佳煎煮工藝。