阿帕替尼聯合放療對HeLa細胞Ki－67表達的影響及與生長抑制相關性研究

彭紅菊，劉 偉，張建文 ，岳宏程，傅少志

（西南醫科大學附屬醫院腫瘤科，四川 瀘州 646000）

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見惡性腫瘤，發展中國家發病率高[1]，2009和2010年位居中國腫瘤的第10 位[2－3]。阿帕替尼（apatinib）為新一代口服抗血管生成藥物，在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中均具有良好的抗腫瘤作用[4－7]，但與放射治療（簡稱放療）聯合應用的報道較少。本研究中探討阿帕替尼聯合放療治療宮頸癌對Ki－67陽性表達率的抑制作用，以及Ki－67陽性表達率變化與腫瘤生長抑制率的關系。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、儀器與試藥

細胞、動物：對數生長的HeLa細胞株（西南醫科大學附屬醫院）；健康 BALB／c－nu雌性裸小鼠（4～5周齡、體質量18～20 g，重慶騰鑫華阜生物科技公司，動物許可證編號為SCXK＜京＞2014－0004，SPF級飼養）。

儀器：直線加速器（Elekta）；石蠟切片機（德國萊卡儀器有限公司）；新型BGZ系列Ⅱ型高精度烤箱（上海博訊實業有限公司）；移液器（德國艾本德公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

試藥：甲磺酸阿帕替尼片[江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H20140103，規格按阿帕替尼（C24H23N5O）計每片 250 mg]，化學名稱為 N －[4－（1－氰基環戊基）苯基]－2－（4－吡啶甲基）氨基 －3－吡啶甲酰胺甲磺酸鹽，分子式為C24H23N5O·CH4SO3，相對分子質量為493.58。DMEM高糖完全培養基（美國Hyclone公司，胎牛血清∶雙抗∶DMEM培養基體積比為10∶1∶90，配制成 10%的完全培養基）；10%胎牛血清（美國 Hyclone公司）；0.25%胰酶（上海碧云天公司）；青霉素－鏈霉素抗體（上海碧云天公司）；Ki－67抗體（美國 BioWorld 公司）；DMSO（美國 Sigma公司）。

1.2 方法

荷瘤小鼠模型建立及分組：取HeLa細胞株，接種于小鼠右后肢根部皮下，觀察記錄裸鼠一般狀態、體質量、成瘤情況及瘤體積變化。待腫瘤體積達到 100～150 mm3時，荷瘤鼠隨機分為 3組，每組12只。對照組予生理鹽水0.1 mL／d灌胃第1天至第7天；單純放療組（放療組）連續觀察 7 d，第 7天開始放療（Dt＝8 Gy／F×1次×1 d）；阿帕替尼聯合放療組（聯合組）將配制好的阿帕替尼溶液（質量濃度為40 g／L），每只裸鼠按200 mg ／（kg·d）劑量給予灌胃，連續灌胃 7 d，第 7 天灌胃完成后 2 h 行放療（Dt＝ 8Gy／F×1次 ×1 d）。于實驗完成后第2天各組處死6只，采集腫瘤標本，用于Ki－67檢測，余6只用于觀察腫瘤體積變化。

阿帕替尼溶液配制：取阿帕替尼片（規格為每片250 mg），按40 mg阿帕替尼 ∶1 mL 0.9%氯化鈉注射液比例配制成質量濃度為40 g／L的阿帕替尼灌胃液，于開始灌胃前30 min配制備用。

Ki－67表達檢測：采用免疫組化SP法檢測，細胞胞核染色呈棕黃色或褐色判為陽性。隨機選取各組腫瘤組織切片中高倍鏡下5個視野，并計數Ki－67陽性細胞個數，計算5個視野下陽性細胞數占總細胞數的比例即為Ki－67陽性表達率。

腫瘤體積和腫瘤生長抑制率計算：各組于實驗結束后第1天開始，每隔2 d測量各組移植瘤最大直徑（A，mm）與最小直徑（B，mm），直至第 25天。計算各組腫瘤體積（TV）平均值，作為各組最終用于評價TV，根據最終TV 計算腫瘤生長抑制率（TGIR），TV＝ A×B／2；TGIR＝（TV對照組－單純放療組 ／TV聯合組）／TV對照組×100%。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，行獨立樣本 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki－67 陽性表達率

聯合組Ki－67陽性表達率低于15%，放療組高于60%，分別比對照組降低 84.49%和 28.06%；聯合組Ki－67陽性表達率比放療組降低78.44%，差異有統計學意義（P ＜0.05）。詳見表 1和圖 1。

表1 各組 Ki－67表達情況比較（±s，n＝6）

表1 各組 Ki－67表達情況比較（±s，n＝6）

注: 為與對照組比較， 為與放療組比較。下表同。

P1值 ／t1值P2值 ／t2值組別對照組放療組聯合組陽性表達率（±s，%）92.83 ± 4.04 66.78 ± 5.01 14.40 ± 2.72 0.00 ／7.01 0.00 ／16.810.00 ／15.91

圖1 腫瘤Ki－67表達情況（×400）

2.2 腫瘤體積和TGIR

聯合組腫瘤體積最小，對照組最大，差異有統計學意義（P＜0.05）。聯合組和放療組腫瘤體積分別比對照組縮小52.55%和32.64%，聯合組比放療組縮小29.56%。聯合組TGIR最高，比放療組高22.17%。詳見表2。

3 討論

Ki－67是反映腫瘤細胞增殖活性的指標，在腦膜瘤、結直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等多種腫瘤中均有不同程度表達[8－12]。世界衛生組織（WHO）Ⅱ級腦膜瘤中，Ki－67的平均表達值為 13% （1% ～47% ）[8]。結直腸癌中，Ki－67表達陽性表達率≥20%[9]。組織學檢測宮頸上皮內瘤變1，2，3級Ki－67陽性表達率分別為2.13% ，19.93% 和 23.22% ，宮頸癌中 Ki－ 67 陽性表達率為 69.72% ～ 75.0%[12－13]。提示宮頸癌是具有高度增殖活性的腫瘤。本研究中，宮頸癌HeLa細胞Ki－67陽性表達率為（92.83 ±4.04）% ，高于文獻[12 －13]報道，預示宮頸癌HeLa細胞是具有高增殖活性。

腫瘤組織中Ki－67陽性表達率高低與預后有相關性。WHOⅡ級腦膜瘤術后放療與Ki－67表達研究顯示，局部復發患者Ki－67平均表達值為15%，無復發患者 Ki－67平均表達值為12%，Ki－67＞13%顯著影響局部控制率[8]。三陰乳腺癌新輔助化療，病理完全緩解和無效的Ki－67表達顯著截止值為20%[14]。結直腸癌中Ki－67表達與TNM分期密切相關，TNM分期越高，Ki－67表達越高，Ki－67高表達的5年無復發生存率為 53%，Ki－67低表達為 89%[9]。宮頸癌 Ki－67陽性表達中位總生存期55個月，陰性表達60個月，局部控制率分別為 80.7%和 89.2%[15]。因此，宮頸癌 Ki－67陽性表達對生存期和局部控制率均有影響。

降低腫瘤組織中Ki－67表達水平，有可能改善患者預后。宮頸癌研究中，卡鉑＋紫杉醇聯合化療，可使Ki－67陽性表達率由化療前的76.00%降至化療后的20.00%[16]。本研究結果提示，宮頸癌單純放療對Ki－67陽性表達率抑制非常有限，在放療基礎上聯合阿帕替尼可明顯抑制Ki－67陽性表達率，預示阿帕替尼聯合放療能明顯抑制宮頸癌HeLa細胞增殖活性。

腫瘤體積越大，負荷越大，腫瘤生長越快，腫瘤生長抑制率越低，無論是化療、手術治療，還是放療，首要結果是降低腫瘤負荷，提高腫瘤生長抑制率。因此，腫瘤生長抑制情況與抗腫瘤治療相關[17]，紫杉醇、他莫昔芬等與腫瘤生長抑制研究較多相關[18－19]。本研究結果提示，阿帕替尼聯合放療能使宮頸癌HeLa細胞腫瘤體積明顯縮小，效應遠大于單純放療，腫瘤生長抑制率提高。宮頸癌阿帕替尼聯合放療可能存在明顯協同作用。

綜上所述，宮頸癌阿帕替尼聯合放療可明顯抑制Ki－67陽性表達率，抑制宮頸癌HeLa細胞增殖活性，導致腫瘤體積縮小，提高腫瘤生長抑制，可能存在明顯協同抗腫瘤作用，Ki－67陽性表達率降低是可能機制。建議Ki－67陽性表達率較高的宮頸癌患者臨床使用。