燥濕止癢洗液質量標準提升研究

張 培，陳曉雙，費小凡，宋 毅

（四川大學華西醫院臨床藥學部，四川 成都 610041）

燥濕止癢洗液是由黃柏、黃芩、蛇床子、冰片等13味中藥材制成的外用液體制劑，具有清熱燥濕、殺蟲止癢的功效，是本醫院的臨床驗方，具有10多年的使用歷史。四川省食品藥品監督管理局標準項下僅對黃柏和冰片進行了薄層鑒別，而燥濕止癢洗液中黃連和黃柏中均含有小檗堿成分，陰性有干擾，專一性差，為了更好地對燥濕止癢洗液進行質量控制，現新增黃芩、蛇床子的薄層色譜（TLC）鑒別。黃芩具有清熱、燥濕作用，主要活性成分為黃酮類化合物[1]，其中黃芩苷是黃芩發揮功效的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、解熱鎮痛、抗炎等作用[2]。因此，本研究中將黃芩苷作為黃芩檢測的指標成分。蛇床子功能燥濕祛風、殺蟲止癢、溫腎壯陽，用于陰癢帶下、濕疹瘙癢、溫痹腰痛等癥狀[3]。蛇床子及其制劑臨床應用非常廣泛，主要用于治療濕疹等各種瘙癢病癥[4]，是燥濕止癢洗液中主要活性成分，故同時選用蛇床子素作為質量標準提升的指標[5]。本研究中完善了燥濕止癢洗劑的質量標準，可為臨床用藥安全提供更合理的保障。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AS3120型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；ZF－90型多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；XP205DR型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒－托利多集團）；IRD－7080型鼓風干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；LP2102型電子天平（常熟市鴻泰儀器儀表技術有限公司）。自制硅膠G薄層板[取薄層層析硅膠G（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）適量，按1∶3的比例加入含0.3%羧甲基纖維素鈉的水溶液混勻自制薄層板，晾干后，于110℃ 烘30 min，置干燥器內存放備用]；薄層硅膠G板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；1 μL定量點樣毛細管（華西醫科大學儀器廠）。

1.2 試藥

黃芩對照藥材（批號為 120955－200406），黃芩苷對照品（批號為110715－200514），蛇床子對照藥材（批號為 121030－200405），蛇床子素對照品（批號為110822－201308），均購于中國藥品生物制品檢定所；燥濕止癢洗液（醫院制劑，批號分別為180305，180312，180319）；冰乙酸（重慶化學試劑廠）；丙酮（成都光華化學廠）；甲酸，甲苯，硫酸，無水乙醇，乙酸乙酯，丁酮，甲醇，正己烷，環己烷（分析純，成都市科龍化工試劑）。

2 方法與結果

2.1 黃芩的鑒別[6－7]

2.1.1 溶液制備

供試品溶液：取燥濕止癢洗液10 mL，乙酸乙酯－甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，分別按以下3種方法提取。1）加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液1[3]；2）超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液2；3）浸漬過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液3。

對照藥材溶液：取黃芩對照藥材1 g，同法分別制成對照藥材溶液。

對照品溶液：取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 薄層色譜條件考察

展開系統選擇：分別吸取 2.1.1項下的最佳供試品、對照藥材和對照品3種溶液點于同一聚酰胺薄膜上，以展開劑（甲苯－丙酮 －甲醇 －冰乙酸（8∶1∶1∶1）][8]，展開，取出晾干，置紫外燈下（365 nm）下檢視；分別吸取2.1.1項下的最佳供試品、對照藥材和對照品3種溶液點于同一硅膠G薄層板上，用展開劑[甲苯－乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸（9 ∶3 ∶2 ∶2][9]，展開，取出晾干，在日光下放置30 min后直接觀察；分別吸取2.1.1項下的最佳供試品、對照藥材和對照品3種溶液點于硅膠G薄層板上，以展開劑[乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（6 ∶3 ∶2 ∶1）]，展開，取出，晾干，噴以 2% 三氯化鐵乙醇溶液，晾干后檢視。結果，展開劑1斑點拖尾嚴重，斑點模糊；展開劑2各斑點明顯，Rf值適中，但是陰性干擾嚴重，專屬性差。故最終選擇展開劑3[乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（6∶3∶2∶1）]作為黃芩的最佳展開系統。

點樣量選擇：吸取2.1.1項下的最佳供試品、對照藥材和對照品 3 種溶液各 2，4，5，10 μL，點于同一聚酰胺薄膜上和硅膠G薄層板上，以“展開系統選擇”項下選出最佳檢視條件同法檢視。結果，根據斑點的清晰度和 Rf值確定，黃芩供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液的最佳點樣量均為10 μL。

檢視條件考察：吸取2.1.1項下的最佳供試品、對照藥材和對照品3種溶液，在選出的最佳展開系統（展開劑3，點樣量10 μL）中展開，取出晾干，分別在紫外燈（254 nm和365 nm）下，或噴以2%三氯化鐵乙醇溶液；或日光下放置30 min后直接觀察。結果，黃芩特征斑點在噴以2%三氯化鐵乙醇溶液后斑點顯示清晰，陰性無干擾。

專屬性考察：取處方中除黃芩以外的所有藥材，按照燥濕止癢洗液制備工藝制得陰性樣品，按最佳供試品溶液的制備方法，同法制成陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液 10 μL 和 2.1.1 項下 3 種溶液，以“展開系統選擇”“點樣量的選擇”“檢視條件考察”項下選出最佳檢視條件進行檢視。結果，在專屬性考察薄層色譜中，陰性對照品溶液與對照品溶液和對照藥材相應的位置上顯示無斑點，說明黃芩專屬性良好。

溫度和相對濕度考察[10－11]：取 2.1.1 項下的 3 種溶液，按照“點樣量的選擇”項下進行點樣，分別在不同的溫度和相對濕度環境中展開，濕度條件通過在展開缸的一端加入不同比例的硫酸控制。溫度和相對濕度條件見表1。結果，在4℃及25℃條件下，黃芩斑點均顯示清晰的斑點，但 Rf值略有差別，考慮薄層鑒別的方便性和適用性，故選擇35℃作為黃芩TLC的最佳溫度環境；濕度在88%時各斑點分離影響小，分離效果良好。

不同薄層板考察：取2.1.1項下的 3種溶液，分別點于市售硅膠G薄層板、自制硅膠G薄層板和聚酰胺薄膜上，按“檢視條件考察”項下的方法檢視。分別對市售薄層板、自制薄層板和聚酰胺薄膜進行考察，結果顯示聚酰胺薄膜載藥量少，陰性對照溶液與對照品溶液和對照藥材在相應的位置拖尾嚴重，難以辨認出特征斑點；而自制薄層板存在鋪板時固定相和流動相不均勻，厚度不一，硅膠板活性不穩定等影響因素，導致斑點不清晰、拖尾等現象。故選擇市售薄層板進行試驗。

表1 不同溫度和相對濕度條件

2.1.3 黃芩 TLC

按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502法[12]進行薄層色譜鑒別：1）展開系統，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸 － 水（6 ∶3 ∶2 ∶1）為展開劑，取出，晾干。2）點樣量，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。3）檢視條件，噴2%三氯化鐵乙醇溶液，晾干后檢視，斑點明顯。色譜圖見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖

2.2 蛇床子的鑒別[13－14]

2.2.1 溶液制備

取燥濕止癢洗液 20 mL，濃縮至約 3 mL，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為蛇床子的供試品溶液。取蛇床子對照藥材0.3 g，同法制成對照藥材溶液。取蛇床子素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 薄層色譜考察

展開系統選擇：分別吸取2.2.1項下的3種溶液，分別點于硅膠G薄層板上，分別以甲苯－乙酸乙酯－正己烷（3 ∶3 ∶2）[3]、環己烷 － 乙酸乙酯（4 ∶1）[15]、甲苯 －甲醇 － 甲酸（10 ∶2 ∶1）為展開劑，上展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結果，前兩種展開劑下，斑點拖尾嚴重，分離效果不理想；第3種展開劑下，各斑點清晰且分離良好，Rf值適中，陰性無干擾。通過斑點的 Rf值、分離度、拖尾情況，選擇甲苯－甲醇－甲酸（10∶2∶1）作為本品的最佳展開系統。

點樣量選擇：吸取 2.2.1項下的 3種溶液各 2，5，10，20 μL，點于同一硅膠 G薄層板上，以“展開系統選擇”“點樣量選擇”項下同法檢視。結果，根據斑點的清晰度和分離度確定供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液的最佳點樣量均為10 μL。

檢視條件考察：吸取 2.2.1項下的 3種溶液，在“展開系統選擇”項下的最佳展開系統下展開，取出，晾干，分別于302 nm和365 nm波長處（紫外燈）檢視。結果，本品特征斑點在紫外燈365 nm下觀察時吸收最大，熒光斑點最明顯，故確定以365 nm作為最佳檢視條件。

專屬性考察：取除蛇床子外的其他藥材制成陰性品對照溶液。吸取陰性對照品溶液10 μL和2.2.1項下的3種溶液，按照“檢視條件考察”項下條件同法檢視。結果，陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜和對照藥材色譜相應的位置上無斑點，供試品各組分離良好，表明該方法的專屬性良好。

溫度和相對濕度考察：吸取 2.2.1項下的 3種溶液，按照“點樣量選擇”項下方法點樣，分別在不同溫、相對濕度條件展開（見表1）。結果，在溫度25℃、相對濕度65%條件下，各目標斑點在對應位置上斑點清晰，分離度良好。

不同薄層板考察：取2.2.1項下的 3種溶液，分別點樣于市售硅膠G薄層板、自制硅膠G薄層板，按“檢視條件考察”項下方法檢視。結果顯示，聚酰胺薄膜載藥量少，陰性對照品溶液與對照品溶液和對照藥材在相應的位置拖尾嚴重，難以辨認出特征斑點；自制薄層板存在鋪板時固定相和流動相不均勻，厚度不一，硅膠板活性不穩定等影響因素，導致斑點不清晰、拖尾等現象。故選擇市售薄層板進行試驗。

2.2.3 蛇床子 TLC

按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502法[12]進行薄層色譜鑒別：1）以甲苯 －甲醇 －甲酸（10∶2∶1）為展開劑，取出，晾干。2）點樣量，吸取供試品溶液10 μL，對照藥材溶液和對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。3）檢視條件，置紫外燈365 nm下觀察，熒光斑點明顯。色譜圖見圖1 B。

3 討論

燥濕止癢洗液由13味中藥材構成，組分較多，成分復雜，不同藥材含有相同有效成分，如黃芩和甘草均含有黃酮類有效成分[16]，參考2015年版《中國藥典（一部）》[3]選取黃芩素作為薄層色譜鑒別指標成分，目標斑點不清晰，陰性干擾嚴重，專屬性差。本研究結果顯示，以黃芩中黃芩苷作為指標成分，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（6∶3∶2∶1）為展開劑，在硅膠 G板上斑點顯示清晰、陰性無干擾，具有較強的專屬性。故最終確定以黃芩苷作為黃芩的指標成分。但其他藥材的有效成分和黃芩地均被提取出來，且性質相似，導致無法分離出指標成分或分離效果差。又考察了黃芩的提取方法，即分別采用加熱回流30 min、超聲30 min和浸泡過夜的方法，結果采用超聲提取30 min時，黃芩苷的含量最高。

參考2015年版《中國藥典（一部）》中蛇床子項下的薄層鑒別方法進行試驗[3]，目標斑點模糊，拖尾嚴重。這可能是因為蛇床子素屬于香豆素類化合物[17]，脂溶性較強，在乙醇中溶解度較低。本研究結果顯示，蛇床子在甲醇中溶出效果好，故選擇甲醇作為蛇床子的提取溶劑，同時考察了超聲30 min、加熱回流30 min、浸漬過夜等提取方法，發現浸漬過夜法浸出率低，加熱回流法易造成成分分解，薄層板上樣點淺顯難辨，最終確定采用超聲30 min為最佳提取方法。

綜上所述，通過對燥濕止癢洗劑中黃芩和蛇床子兩種藥材薄層鑒別方法進行優化，該方法能快速、準確且陰性無干擾地進行定性鑒別，簡便、易操作，并經不同實驗人員試驗均能測出，結果穩定，重復性很好。