Bax在普萘洛爾誘導人血管瘤內皮細胞凋亡中的作用

姚天華　KrishnaRegmi　杜婧婷

[摘要]目的：通過不同濃度的普萘洛爾干預體外培養的血管瘤內皮細胞，探討Bax基因在普萘洛爾誘導血管瘤內皮細胞凋亡中的作用。方法：體外培養人增殖期血管瘤內皮細胞，分別加入不同濃度的普萘洛爾藥物干預，選擇適宜的研究濃度及觀察時間。構建Bax基因高表達及低表達組，檢測其表達差異對于血管瘤內皮細胞凋亡的影響。結果：經普萘洛爾干預后細胞呈凋亡形態學改變，且隨著藥物濃度和藥物作用時間的增加，細胞凋亡率也相應增加，其中300μmol/L的普萘洛爾干預24h時細胞凋亡率為28.49%，此為本實驗中普萘洛爾誘導血管瘤內皮細胞凋亡的最佳藥物濃度和時間點。Bax高表達組細胞構建成功后，經普萘洛爾干預，BAM7+普萘洛爾組>DMSO+普萘洛爾組>普萘洛爾組>BAM7組>空白對照組。Bax低表達組構建成功后，經普萘洛爾干預，Bax siRNA+普萘洛爾組>N.C siRNA+普萘洛爾組>轉染試劑+普萘洛爾組>普萘洛爾組>空白對照組。結論：300μmol/L的普萘洛爾干預24h，是普萘洛爾誘導血管瘤內皮細胞凋亡的最佳藥物濃度和時間點。Bax與普萘洛爾誘導血管瘤內皮細胞凋亡密切相關，Bax表達量越高，普萘洛爾誘導血管瘤內皮細胞凋亡的能力越強，Bax表達量降低，血管瘤內皮細胞凋亡無明顯變化。

[關鍵詞]普萘洛爾；血管瘤；凋亡；Bax；BAM7；siRNA

[中圖分類號]R732.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2019）01-0100-05

The Effect of Bax on Propranolo Induced Hemangioma Endothelial Cell Apoptosis

YAO Tian-hua1，2，KRISHNA Regmi1，3，DU Jing-ting4，SHI Jing-yi1，3，HU Xiao-yi1，3，LI Li-feng1，3，TU Jun-bo1，3

（1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research；2.Department of General Dentistry；3.Department of Oral Maxillofacial Surgery，Xi'an Jiaotong University Stomatology Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China；4.Department of Stomatology，People's Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277000，

Shandong，China）

Abstract： Objective Hemangioma endothelial cell （HemEC） which is cultured in vitro is intervened by different concentrations of propranolol. To verify the effect of Bax on propranolo induced HemEC apoptosis. Methods Different concentrations of propranolol were added to HemEC which was cultured in vitro， select the most meaningful group and time point. Adopt the Bax activator to build the high model and the low expression group. The effect of expression difference on apoptosis of endothelial cells in hemangioma was detected. Results After intervented， the HemECs performanced apoptotic morphological changes， as the drug concentration and the intervention time increased， the apoptosis rate increased too. The intervention factors that be intervented by 300μmol/L after 24 hours which apoptosis rate was 28.49% is believed to be significance. With the high expression of Bax mRNA，after propranolol intervention， BAM7+propranolol>DMSO+propranolol>propranolol>BAM7>control group. With the low expression groups，after propranolol intervention， Bax siRNA+propranolol>N.C siRNA+ propranolol>transfection reagent+propranolol>propranolol>control group. Conclusion The optimal concentration and time point of pronaphthol in inducing apoptosis of endothelial cells in hemangioma was 300 mol/L of pronaphthol intervention for 24 hours.Bax gene is closely related with HemEC apoptosis induced by propranolol， the higher expression of Bax gene， the ability to induce the apoptosis is stronger.

Key words： propranolol； hemangioma； apoptosis； Bax； BAM7； siRNA

血管瘤是嬰幼兒最常見的血管源性良性腫瘤[1]，新生兒的患病率約為2%～3%，1歲以內血管瘤患病率達10%[2]。血管瘤可存在于身體的任何部位，但是主要發生在頭頸部區域（60%）[3]，其次是軀干（25%）和四肢（15%）。血管瘤在患兒剛出生時通常很難被察覺，常伴隨明顯的生物學行為：在患兒出生1周后進入迅速生長階段；在患兒3～6月期間持續增殖；穩定幾個月后，于患兒1歲以后進入自發消退階段，此消退過程通常持續5～7年[4]。目前關于血管瘤的消退機制更傾向于是由細胞凋亡引起的。研究發現消退期的嬰幼兒血管瘤的凋亡率是增殖期的5倍，而且凋亡的主要是血管瘤內皮細胞（Hemangioma endothelia cell， HemEC）[5]。消退期嬰幼兒血管瘤組織中，Fas、Bax、Caspase-3等凋亡相關基因呈高表達，而凋亡抑制基因Bcl-2表達則相對較低[6]。本課題研究Bax的表達量與普萘洛爾誘導體外培養的人血管瘤內皮細胞凋亡的關系，為明確血管瘤內皮細胞的凋亡途徑奠定分子生物學基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和檢測儀器：鹽酸普萘洛爾粉劑（武漢欣欣佳麗生物科技有限公司）、SABC免疫細胞化學試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）、AnnexinV-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（上海七海復泰生物科技有限公司）、BAM7（美國Med Chem Express公司）；Real Time PCR儀（美國Bio-Rad公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix（日本TaKaRa公司）；Trizol Reagent（美國ambion公司）；SYBR Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）；DNA Transfection Reogent（美國Polyplus公司）；siRNA合成（上海吉瑪制藥有限公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 細胞培養及鑒定：血管瘤內皮細胞來源于西安交通大學第二附屬醫院小兒外科惠贈的人增殖期血管瘤內皮細胞，將其培養于含10%胎牛血清的1 640培養基中，37℃、5% CO2細胞培養箱中傳代培養，一般選擇細胞性狀相對穩定的第5～6代細胞。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄細胞形態，并用免疫細胞化學法檢測第Ⅷ凝血因子相關抗原的表達。

1.3 不同濃度普萘洛爾溶液干預：細胞分組：空白對照組： 0μmol/L；實驗組：100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L。取處于對數生長期的人血管瘤內皮細胞，接種于12孔板中，每組設3個復孔，分別加入不同濃度的普萘洛爾溶液（100、200、300、400umol/L，24h），倒置顯微鏡下連續動態觀察24h，分別記錄（0h、6h、12h、18h、24h）細胞的形態變化。同時用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測血管瘤內皮細胞的凋亡。篩選出本次實驗所用的藥物濃度和作用時間。

1.4 Bax高表達細胞模型的構建：取對數期的細胞鋪6孔板后培養24h，細胞貼壁后，分別加入Bax激活劑BAM7，其濃度依次為1μmol/L、1.65μmol/L、3.75μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L。分別處理1h、3h、6h、12h，換液，加入普萘洛爾溶液，篩選出有意義的BAM7濃度及預處理時間組。

1.5 Bax低表達細胞模型的構建：利用NCBI數據庫獲取人Bax mRNA的序列全長（NM_001291428）結合Roche公司提供的RNAi軟件設計和文獻報道，確定Bax siRNA和陰性對照siRNA（合成的siRNA序列模板見表1），應用blast軟件在人類基因組中進行比對以保證和其他基因沒有同源性，由上海吉瑪基因化學合成。

表1 Bax siRNA模板序列

siRNA Sequence

Bax siRNA-1（sense） 5-GGUGCCGGAACUGAUCAGATT-3

Bax siRNA-1（antisense） 3-TTCCACGGCCUUGACUAGUCU-5

Bax siRNA-2（sense） 5-AACUGAUCAGAACCAUCAUGG-3

Bax siRNA-2（antisense） 3-UUGACUAGUCUUGGUAGUACC-5

Bax siRNA-3（sense） 5-CCAUCAUGGGCUGGACAUUTT-3

Bax siRNA-3（antisense） 3-TTGGUAGUACCCGACCUGUAA-5

N.C siRNA-RL（sense） 5-GCGACGAUCUGCCUAAGAUTT-3

N.C siRNA-RL（antisense） 3-TTCGCUGCUAGACGGAUUCUA-5

取對數生長期的HemEC接種于12孔板中，培養約24h，加入siRNA-jetPRIME復合物，然后置于培養箱中生長，培養24～72h。實驗組分為siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3三組，對照組分為空白對照組、轉染試劑組、陰性對照組。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 qRT-PCR檢測Bax高表達及低表達時HemEC模型的構建：6孔板培養HemEC，加入1ml Trizol試劑裂解；加入200μl氯仿，冰上放置5min，4℃，12 000轉/min離心15min，吸取上層水相至另一Ep管中，加入500μl異丙醇，4℃，12 000轉/min離心10min；棄去上清液，75%乙醇懸浮沉淀，4℃，7 500轉/min離心5min；棄去上清，室溫晾干，加入DEPC水溶解沉淀。NanoDrop 1 000分光光度計（Nucleic Acids）檢測所提取的mRNA的濃度與純度，即A260/A280值及RNA濃度。按照TaKaRa公司說明書進一步進行逆轉錄和Real Time PCR反應，反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，每個樣本設3個平行復孔，并重復進行3次獨立實驗。2-△△CT表示Real Time PCR實驗中分析基因表達的相對變化。

1.7 Bax高表達時HemEC凋亡率的檢測：①實驗分組：空白對照組、普萘洛爾組、DMSO+普萘洛爾組、BAM7組、BAM7+普萘洛爾組；②依據所購上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作；③實驗可重復性：每組樣本均設置3個復孔，并重復3次獨立實驗。

1.8 Bax低表達時HemEC凋亡率的檢測：①實驗分組：實驗分為5組：空白對照組、普萘洛爾組、轉染試劑+普萘洛爾組、N.C siRNA+普萘洛爾組、Bax低表達組（siRNA+普萘洛爾組）；②加入普萘洛爾：a.siRNA轉染后24h，換液后加入普萘洛爾；b.調整藥物濃度為300μmol/L，藥物作用24h后取樣待檢；c.依據所購上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作；③實驗可重復性：每組樣本均設置3個復孔，并重復3次獨立實驗。

1.9 統計學分析：采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計分析，實驗所得數據以均數±標準差形式表示，采用獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血管瘤內皮細胞鑒定：血管瘤內皮細胞在培養瓶生長良好，采用倒置相差顯微鏡觀察可見：細胞單層貼壁生長，多角形或卵圓形，排列緊張時鑲嵌排列，似“鋪路石”樣結構，有接觸抑制現象，高倍鏡下可見細胞偽足充分伸展，界限清晰。見圖1。

凋亡率的結果提示：BAM7+普萘洛爾組>DMSO+普萘洛爾組>普萘洛爾組>BAM7組>空白對照組，說明DMSO本身能對細胞造成一定的損害，由于BAM7是由DMSO配制的，為排除DMSO對細胞的影響，設置了DMSO+普萘洛爾組，發現其與普萘洛爾組的凋亡率無明顯差異；BAM7組與空白對照組無差異說明Bax水平本身上調并不會引起細胞凋亡，只有當BAM7與普萘洛爾同時作用時才能誘導HemEC凋亡率上升，與普萘洛爾組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.6 Bax低表達細胞模型的建立：將N.C siRNA、Bax siRNA01、Bax siRNA02、Bax siRNA03（antisense）轉染HemEC，Real-time PCR篩選出能最大程度沉默Bax基因的siRNA，結果如圖6所示，故本實驗選擇Bax siRNA01轉染細胞來構建Bax的低表達模型。

2.7 Bax低表達時HemEC凋亡率檢測：用流式細胞儀檢測Bax低表達情況下普萘洛爾對HemEC凋亡的影響。凋亡率結果，Bax siRNA+普萘洛爾組>N.C siRNA+普萘洛爾組>轉染試劑+普萘洛爾組>普萘洛爾組>空白對照組，說明轉染試劑本身有一定的細胞毒性，在siRNA誘導Bax基因低表達時，細胞凋亡率無明顯差異。見圖7。

3 討論

嬰幼兒血管瘤增殖期，HemEC處于分裂活躍階段，嬰幼兒血管瘤消退期，HemEC則表現為凋亡狀態，HemEC增殖與凋亡的病理失衡狀態，才是嬰幼兒血管瘤生物學行為的本質所在，因而許多學者認為嬰幼兒血管瘤的自然消退與HemEC的凋亡密切相關[2，4，7]，并且有研究證實普萘洛爾可以誘導體外培養的HemEC的凋亡或抑制其增殖[8-10]。

本實驗中的HemEC來源于增殖期嬰幼兒血管瘤組織，體外培養可見細胞處于分裂增生活躍狀態，細胞自發凋亡少。加入不同濃度的普萘洛爾藥物后，倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化，發現當普萘洛爾濃度低于400?mol/L時，細胞收縮、變圓，細胞界限模糊、間隙增大，細胞脫壁、游離，但細胞膜仍保持完整，這些現象均符合細胞凋亡的特性。由此筆者可以得出普萘洛爾誘導嬰幼兒血管瘤消退可能與HemEC的凋亡有關。

Bax是Bcl-2基因家族中的重要調節者，Bid、Bim可作為活化劑，直接激活Bax，觸發Cytc的釋放；Bad、Nova等與抗凋亡蛋白競爭性結合替換出Bid、Bim等間接激活Bax[11]。它能與凋亡抑制基因Bcl-2等結合形成異二聚體，從而中和它們的作用，Bax自身可形成同二聚體Bax/Bax，正常細胞中，Bax是以非激活單體形式存在，凋亡信號被激活后，Bax構象發生改變，激活Bax蛋白[12]，發出線粒體定位信號從而聚集到線粒體上，進而介導線粒體凋亡，因而Bax易位到線粒體上是線粒體凋亡信號轉導中的關鍵。

研究[13]表明用免疫組化法染色的嬰幼兒血管瘤組織中Bax和Bcl-2均有表達，在嬰幼兒血管瘤增殖期Bcl-2表達升高，Bcl-2/Bax結合增多， 抑制細胞凋亡， 消退期中Bax表達上調， Bax/Bax結合增多， 促進細胞凋亡， 這些研究結果提示Bax與Bcl-2比率的變化可能導致嬰幼兒血管瘤從增殖期進入消退期[14]。研究[15]表明口服普萘洛爾治療后的嬰幼兒血管瘤組織較普萘洛爾治療前的嬰幼兒血管瘤組織中的Bax、Caspase-9基因的mRNA和蛋白表達水平上升，Bcl-2表達水平下降。

前期實驗中研究團隊檢測到了Bax的mRNA和蛋白表達水平在普萘洛爾誘導后的HemEC中表達上調，體外研究也證實了消退期的血管瘤組織中有Bax的高表達。BAM7是由Gavathiotis[16]提出的一種小分子化合物，有BH3結構域凹槽能直接特異性的激活Bax，參與Bax的觸發位點，促進Bax的寡聚化，有效激活Bax線粒體轉位的發生，能以Bax依賴的方式誘導細胞凋亡。據文獻報道在成神經細胞瘤細胞、Hela細胞等腫瘤細胞中特異性激活Bax進而誘導細胞凋亡[17-19]。本實驗在以往報道的基礎上，設置濃度梯度和時間梯度實驗，篩選出最佳作用濃度和時間，即5μmol/L的BAM7預處理1h可以明顯上調Bax。研究還通過siRNA技術[20]沉默Bax基因后轉入細胞內，qRT-PCR顯示Bax明顯受到抑制。

通過實驗研究，Bax基因高表達時，普萘洛爾誘導的HemEC凋亡率明顯上升，這說明Bax參與了普萘洛爾誘導的HemEC凋亡。但當Bax基因沉默后，細胞凋亡率并未明顯下降。這一方面提示Bcl-2家族蛋白種類繁多，且蛋白之間存在協同作用，當Bax表達下降時，Bcl-Xs等可以繼續與Bcl-2形成異源二聚體，或者Bak可以將Bcl-2/Bax二聚體中的Bax置換出來，使Bax游離出來形成同源二聚體等，因而細胞凋亡并未受到明顯抑制；另一方面也提示普萘洛爾誘導HemEC的凋亡并非只有p53/Bax這一線粒體信號傳導途徑，還可能通過膜受體等其它途徑介導HemEC發生凋亡。

[參考文獻]

[1]Dadras SS，North PE，Bertoncini J，et al.Infantile hemangiomas are arrested in an early developmental vascular differentiation state[J].Mod Pathol，2004，17（9）：1068-1079.

[2]Jacobs AH，Walton RG.The incidence of birth-marks in the neonate[J].Pediatrics，1976，58（2）：218-222.

[3]Chiller KG，Passaro D，Frieden IJ.Hemangiomas ofinfancy：clinical characteristics，morphologic subtypes and their relationship to race，ethnicity，and sex[J].Arch Dermatol，2002，138（12）：1567-1576.

[4]Bruckner AL，Frieden IJ.Hemangiomas of infancy[J].J Am Acad Dermatol，2003，48（4）：477-493.

[5]Hasan Q，Roger BM，Tan ST，et al.Clusterin/ApoJ expression during the development of hemangioma[J].Hum Path，2000，31（6）：691-697.

[6]Yang H，Deng C，Shen S， et al.Expression and significance of Bcl-2，Bax，Fas and caspase-3 in different phases of human hemangioma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（4）：402-404.

[7]Kleiman A，Keats EC，Chan NG，et al.Evolution of hemangioma endothelium[J].Exp Mol Pathol，2012，93（2）：264-272.

[8]Ge J，Zheng J，Zhang L，et al.Oral propranolol combined with topical timolol for compound infantile hemangiomas：a retrospective study[J].Sci Rep，2006，6：19765

[9]Chang LC，Haggstrom AN，Drolet BA，et al.Growth characteristics of infantile hemangiomas：implications for management[J].Pediatrics，2008，122（2）：360-367.

[10]Huoh KC，Rosbe KW.Infantile hemangiomas of the head and neck[J].Pediatr Clin North Am，2013，60（4）：937-949.

[11]Ouyang H，Furukawa T，Abe T，et al.The Bax gene，the promoter of apoptosis，is mutated in genetically unstable cancers of the colorecum，stomach，and endometrium[J].Clin Cancer Res，1998，4（4）：1071-1074.

[12]Yu C，Bret B，Yang L，et al.Mitochondrial Bax translocation partially mediatessynergistic cytotoxicity between histone deacetylase inhibitors and proteasome inhibitorsin glioma cells[J].Neuro Oncol，2008，10（3），309-319.

[13]黃鶯，王康敏，李恭才，等.嬰幼兒血管瘤組織中bcl-2和bax與細胞凋亡的研究[J].中華小兒外科雜志，2005，26（3）：116-118.

[14]Yin XM， Oltval ZN， Korsmeyer S J，et al.BH1 and BH2 domains of bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodime rization with Bax[J].Nature，1994，369（6478）：321-323.

[15]李銘，郭志輝，謝義德，等.口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤相關生長因子及凋亡因子表達水平的影響[J].解放軍醫學雜志，2015，40（2）：

121-127.

[16]Gavathiotis E，Reyna DE，Bellairs JA，et al.Direct and selective small-molecule activation of proapoptotic BAX[J].Nat Chem Biol，2012，8（7）：639-645.

[17]Wu CR，Tsai CW，Chang SW，et al.Carnosic acid protects against 6-hydroxydo pamine-induced neurotoxicity in in vivo and in vitro model of Parkinson's disease：Involvement of antioxidative enzymes induction[J].Chem Biol Interact，2015，225：40-46.

[18]Liu Z，Ding Y，Ye N，et al.Direct activation of bax protein for cancer therapy[J].Med Res Rev，2015，36（2）：313-341.

[19]Gama V，Swahari V，Schafer J，et al.PARC/CUL9 Mediates the degradation of mitochondrial-released cytochrome c and promotes survival in neurons and cancer cells[J].Sci Signal，2014，334（7）：67.

[20]Gotoh T，Terada K，Oyadomari S，et al.hsp 70-Dna J chaperone pair prevents nitric oxide-and CHOP-induced apoptosis by inhibiting translocation of Bax to mitochondria[J].Cell Death Differ，2004，11（4）：390.

[收稿日期]2018-10-12 [修回日期]2018-11-19

編輯/賈敏

本文引用格式：姚天華，Krishna Regmi，杜婧婷，等.Bax在普萘洛爾誘導人血管瘤內皮細胞凋亡中的作用[J].中國美容醫學，2019，28（1）：100-104.