微波消融對舌癌Cal-27裸鼠移植瘤凋亡機制的初步研究

張雪松 劉冰 侯春寧 單秋生 林慧 李國林

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤, 目前手術合并放療或化療是其治療的主要方法[1]。由于解剖部位特殊，舌癌術后常影響面部美觀及發音，嚴重影響患者的生存質量。雖然手術技術及輔助治療手段不斷完善,患者5年生存率仍然不到50%[2]。對于一些不能手術治療或治療后效果不佳的患者，尋求合適的可以替代手術的輔助療法十分重要。

微波消融(Microwave ablation, MWA)技術作為一種微創療法已經廣泛應用于臨床，其對多種組織的腫瘤，如肝、乳腺、肺、腎及骨組織等都已取得良好的療效[3-4]，但其應用于口腔鱗癌治療方面的文獻報道少之又少。本研究應用微波消融作用于舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，觀察其對腫瘤細胞的凋亡作用，并結合相關信號轉導通路的變化探討可能的機制，為臨床治療舌癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

BALB/C裸小鼠20 只, 雄性, 4～6 周齡，體重15～21 g(北京維通麗華公司)，舌癌Cal-27細胞株(哈爾濱醫科大學轉化中心實驗室)，MTC-3C型微波消融治療儀(南京維京九洲醫療器械研發中心)，數字化溫度控制器(PKC器械公司,日本)。小鼠抗人PCNAmAb、小鼠抗人Caspase-3 mAb、 SP試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2 實驗動物模型的建立

取對數生長期的舌癌Cal-27細胞，PBS稀釋至細胞密度為1×107/ml，于裸鼠右側腋下接種0.2 ml/每只。接種1 周后裸鼠接種部位皮下出現肉眼可見結節， 2～3 周后待腫瘤長徑長至9～10 mm時進行實驗。

1.3 治療方法及實驗分組

對裸鼠進行腹腔麻醉，在瘤體旁做一小切口并顯露腫瘤，沿腫瘤長軸插入微波消融針至腫瘤中心處。微波功率設為 5 W，測溫針置于距腫瘤中心0.5 cm處，溫度及時間按分組設定。微波消融采用A組：只插入微波消融針不做微波處理，作為對照組，B組： 50 ℃ 1 min，C組： 50 ℃ 2 min， D組： 55 ℃ 2 min分別作用于裸鼠移植瘤。

1.4 觀察指標及標本處理

微波消融結束即刻頸椎脫位處死動物，完整剝離出腫瘤組織。HE染色及免疫組化法:腫瘤組織剝離后，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續切片，厚度4 μm。給予HE染色。免疫組化法測定腫瘤組織中Caspase-3、PCNA的表達。按免疫組織化學SP法操作, 經過預試驗選擇1∶200 和1∶100 分別為PCNA和Caspase-3的一抗稀釋度, 二抗為成品液體4 ℃保存隨取隨用,之后進行DAB顯色, 蘇木素復染, 同時用PBS替代一抗作空白對照。

1.5 結果判定

PCNA蛋白表達以細胞核內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性,Caspase-3蛋白表達以胞質內出現彌漫的棕黃色顆粒為陽性。在低倍鏡下(×100)掃視整張切片，選取5 個視野，然后換成高倍鏡(×400)，計算陽性細胞的百分率。表達強度分為：表達陽性細胞百分率<5%計為(-)；陽性細胞百分率5%～25%計為(+)；陽性細胞百分率26%～50%計為(++)；陽性細胞百分率>50%計為(+++)。 總評標準：(-)計為陰性，(+、 ++、 +++)計為陽性。

1.6 統計學分析

應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析， 多組樣本率組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組移植瘤病理

HE 染色光學顯微鏡觀察各組腫瘤組織病理變化，發現對照組腫瘤細胞整齊排列，核分裂多像多見,瘤塊中央有一小壞死灶，少量腫瘤細胞空泡變性，少見凋亡細胞 (圖 1A)； 50 ℃ 1 min組腫瘤細胞體積縮小，核分裂像減少，壞死范圍加大，腫瘤細胞彌漫性空泡變性，有較多凋亡細胞 (圖 1B)； 50 ℃ 2 min組腫瘤細胞體積變小, 核分裂像少, 壞死灶增多，腫瘤細胞彌漫性空泡變性，凋亡細胞增多(圖 1C)； 55 ℃ 2 min組可見腫瘤組織壞死明顯，大部分腫瘤細胞空泡變性，極少見核分裂像，凋亡細胞較上組少(圖 1D)。

2.2 各組移植瘤中Caspase-3和PCNA蛋白表達水平

光鏡下觀察實驗組Caspase-3蛋白陽性表達較對照組明顯升高， PCNA蛋白陽性表達較對照組明顯降低(圖 2)。與對照組相比微波消融各組Caspase-3蛋白的表達率有明顯上調趨勢(表 1)，PCNA蛋白的表達率有明顯下調趨勢(表 2)，差異具有統計學意義(P<0.05)。微波消融55 ℃ 2 min組Caspase-3蛋白的表達顯著升高(P<0.01)， PCNA蛋白的表達顯著降低(P<0.01)。

A： 對照組; B: 50 ℃ 1 min組; C: 50 ℃ 2 min組; D: 55 ℃ 2 min組圖 1 各組樣本組織病理學圖像(HE， ×400)A: Control group; B: 50 ℃ 1 min group; C: 50 ℃ 2 min group; D: 55 ℃ 2 min groupFig 1 Histo-pathological images of the samples of the groups(HE, ×400)

圖 2 各組治療后腫瘤病灶Caspase-3和PCNA蛋白表達(免疫組化， ×400)Fig 2 The expression of Caspase-3 and PCNA protein in tumor lesions after treatment in the groups(IHC， ×400)

表 1 各組微波消融后裸鼠移植瘤組織Caspase-3蛋白表達水平Tab 1 The expression level of caspase-3 protein in the transplanted tumor of nude mice after microwave ablation

表 2 各組微波消融后裸鼠移植瘤組織PCNA蛋白表達水平Tab 2 The expression level of PCNA protein in the transplanted tumor of nude mice after microwave ablation

3 討 論

微波消融術是近年來發展起來的一種微創的治療腫瘤的新方法，其原理是通過電磁輻射電荷發生振蕩致水分子發生翻轉增加動能，摩擦生熱，致使周圍組織加熱，這些熱量可以促使腫瘤內的蛋白質變性, 進而誘導腫瘤細胞發生凋亡甚至凝固性壞死。微波消融適合于具有高水含量的組織，目前已廣泛應用于肺、肝、乳腺、腎及骨等多種組織良惡性腫瘤的治療中[5]。然而微波消融治療舌癌的可行性及療效評估未得到深入研究。

微波消融的臨床治療通常以測溫針采集組織溫度來判斷組織毀損狀態，一般將 60 ℃視為組織發生不可逆凝固毀損的閾值溫度。實際消融中，腫瘤周邊組織達到 60 ℃即刻或者 54 ℃ 保持 3 min 為腫瘤發生有效毀損的指標[6-7]。本實驗采用微波消融治療舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，初步確定了治療舌癌的有效作用溫度及時間范圍，實驗結果顯示3組實驗組均引起裸鼠移植瘤組織細胞凋亡甚至壞死，與文獻報道的有效閾值溫度基本吻合。

在對腫瘤的熱療研究中,較多學者的研究方向主要集中在相對較低溫度的促腫瘤細胞凋亡[8-9]。凋亡是在一種或多種癌基因活化和或抑癌基因失活的調控下發生的細胞程序性死亡的過程,其在維持機體內環境穩定和組織器官的正常發育中起關鍵作用。凋亡的異常導致了細胞增殖和分化的紊亂,促進了細胞向惡性的轉化,最終導致腫瘤的發生與發展。因此,凋亡異常被認為是腫瘤形成過程中的一個重要機制。

在細胞凋亡的信號途徑中,半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific protease-3,Caspase-3)處于細胞凋亡的下游,是凋亡的主要效應分子, 在凋亡過程中起著重要的作用。Caspase-3 處于級聯反應的下游，凋亡通路的共同通道上，當上游不同通路引起刺激或者變化后，Caspase-3 均可被激活，參與細胞的異常病理生理過程，從而引起相應細胞質或者細胞核的蛋白異常，導致細胞凋亡[10]。本研究發現微波消融組裸鼠移植瘤模型中Caspase-3蛋白表達量較對照組顯著增加，并且消融溫度與時間和Caspase-3蛋白的表達量呈正相關。

增殖細胞核抗原(PCNA)是 DNA 聚合酶的輔助蛋白，參與 DNA 的合成，對細胞增殖的啟動有重要作用，在細胞周期調控中起重要作用。PCNA 與細胞增殖有密切的聯系，其表達高低能直接反應細胞的增殖程度，同時，PCNA表達的降低在許多增生性疾病，特別是癌癥的預后中，作為一個評價指標來判斷疾病的預后。此外，PCNA 蛋白還參與細胞損傷介導的凋亡與程序性死亡過程。尤其在腫瘤細胞中，PCNA 的表達高于正常細胞，是衡量細胞存活或者凋亡的重要分子[11]，其表達與細胞增殖有關，在許多癌癥的診斷中有重要價值。文獻報道PCNA基因在口腔鱗癌中高表達，而在正常的口腔黏膜細胞中不表達[12-13]。有學者研究[13]PCNA和 Capase-3的表達呈現出一種顯著的負相關,并且這2 種蛋白表達的負相關與癌癥密切關聯。本研究采用微波消融治療舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，通過HE染色及免疫組化方法檢測消融范圍內腫瘤細胞的凋亡和壞死，從而初步驗證了微波消融對于舌癌治療的有效性，也初步確定了治療溫度及作用時間，為臨床上應用微波消融治療舌癌提供了一定的參考價值。在實驗中，由于受限于裸鼠移植瘤大小，微波消融功率選擇5W目的在于避免功率過大引起腫瘤組織局部溫度過高，同時也便于控制實驗溫度在一恒定數值。HE染色實驗結果證實微波消融可誘導Cal-27細胞發生明顯凋亡，免疫組化實驗結果顯示微波消融組Caspase-3表達較對照組顯著增加，PCNA表達較對照組顯著降低，并且與作用溫度及時間呈正相關，說明微波消融對舌癌的凋亡作用很可能是通過調節Caspase-3和PCNA這兩條信號通路的活化水平來實現的。

綜上所述，微波消融可以通過抑制舌癌細胞增殖，促進細胞凋亡從而達到治療腫瘤的目的。本實驗為微波消融這一微創療法治療舌癌的可能性提供了一定的參考價值，對于一些舌癌晚期不能手術治療或治療后效果不佳的患者，若能應用微波消融微創治療腫瘤就可以減少手術對患者造成的創傷，從而提高生活質量。然而在臨床上應用微波消融治療舌癌還有待進一步研究。