不同化學處理方法對PEEK材料表面改性及生物學行為的影響

李艷華 何東 王菁 吳高義

目前臨床應用的植入材料多為金屬材料如鈦合金等，研究發現這類材料彈性模量較高，而且與人體骨骼應力匹配不足[1]，不耐人體酸堿腐蝕從而釋放金屬離子，造成植入物邊緣骨質流失，種植體松動、脫落，還可為細菌入侵提供通道[2]。該類金屬材料在CT成像時出現“星狀放射”現象，還與MRI不可兼容。生物陶瓷是另外一種重要植入材料，其中以羥基磷灰石最為常用，但其脆性高、強度低、耐疲勞性能差，臨床應用受限[3]。

近期研究發現一種新型線性芳香族、半結晶高分子聚合物-聚醚醚酮(Polyetheretherketone, PEEK)，該材料的彈性模量高度接近皮質骨，具有優越的力學性能、耐磨性以及良好的耐腐蝕性[4]。PEEK及其復合材料作為一種新型的生物材料已逐漸應用于椎間融合、人工關節置換及創傷植入等領域[5]，展現出較好的應用前景。然而PEEK材料的表面疏水性及化學惰性往往限制了PEEK材料的生物性能[6-8]。

為了提高PEEK的生物性能，眾多學者通過物理、化學方法對PEEK及其復合材料進行表面或復合改性。如PEEK與羥基磷灰石(HA)通過共混或冷噴涂技術獲得PEEK-HA復合材料，體內、外實驗發現，PEEK-HA具有優良的生物性能，但是該復合材料的界面結合力依然較差[9-10]。材料表面改性是提高材料表面力學性能和生物學性能的有效途徑，同時也保持了材料本身的優越性[8]。然而，聚合材料的導熱系數較低，很難形成均質的表面，而化學改性操作簡單、重復性高，可形成均質的表面，是很好的選擇。既往研究通過磺化反應，在PEEK材料表面形成三維網狀結構，進一步研究證實，多孔的PEEK材料無論是在體外細胞實驗，骨髓間充質干細胞的前期粘附、增殖、分化或體內動物實驗中種植體周圍新骨的生成均表明磺化后的PEEK具有優良的生物性能[9-10]。研究發現具有相同形貌磺化PEEK，會因材料表面殘余硫(S)而影響材料的生物相容性。本研究探討化學方法改性PEEK材料以提高其生物性能。

1 材料與方法

1.1 制備PEEK試件

將醫用級的PEEK材料(Thornton Cleveleys, United Kingdom)制成10 mm×10 mm×1.0 mm 以及15 mm×15 mm×1.0 mm方形試件, 依次用 600#、800#、1000#、 1200#、 1500#、2000#、3000#、5000#、7000#SiC砂紙逐級打磨、拋光。進一步用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗 10 min，干燥后備用。

1.2 試件分組

A.空白對照組(PEEK)：按 2.1 所述，依次打磨拋光，按順序超聲清洗后干燥備用; B.硫酸磺化5 min組(S1-PEEK)：為了得到大小均質的網狀結構，磁力攪拌貫穿浸泡全過程。按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力攪拌的濃硫酸(濃度約為95%～98%)中，室溫下作用5 min，將薄片取出，置于去離子水中浸泡約5 min，然后置入100 ℃去離子水中加熱4 h; C.硫酸磺化10 min組(S2-PEEK): PEEK薄片放入磁力攪拌的濃硫酸(濃度約為95%～98%)中浸泡作用10 min，其余操作與B組相同; D.硫酸磺化5 min+硝酸組(S+n-PEEK)：磁力攪拌貫穿全過程，按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力攪拌的濃硫酸(濃度約為95%～98%)中作用5 min，將薄片取出放入硝酸(濃度約為65%～68%)中，室溫下50 s，然后將薄片浸沒在去離子水中5 min，最后置入100 ℃去離子水中加熱4 h; E.高錳酸鉀+磷酸蝕刻組(Mn-PEEK)：磁力攪拌貫穿全過程，按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力攪拌的混合溶液中(1 g高錳酸鉀+20 ml 65%～68%的磷酸)室溫下作用20 min，將薄片取出，浸沒于去離子水中5 min，最后置于100 ℃去離子水中加熱4 h。

1.3 檢測PEEK試件表面特性

使用JSM-4800 型 FE-SEM 觀察各組PEEK試件的表面形貌。應用X射線光電子能譜(XPS)檢測制備試件的化學組成。

1.4 統計學分析

1.5 體外實驗

1.5.1 骨髓間充質干細胞的培養 100 g左右SD大鼠(購于第四軍醫大學動物實驗中心)脫臼處死后，75%乙醇浸泡15 min，在無菌操作臺上分離雙側股骨及脛骨，在含生理鹽水的50 mm2玻璃平皿中去除股骨周圍肌肉組織。剪去包括骺板在內的兩側骺端，用10 ml注射器抽取適量PBS+血清混合液沖洗骨髓腔至其發白為止。將細胞懸液以1 200 r/min離心5 min，去除上清液后加入細胞培養液，吹打混勻。置入細胞培養箱中常規培養。

1.5.2 細胞形態學檢測 將對數生長期的骨髓間充質干細胞以2×104cells/cm2密度依次接種到PEEK、 S1-PEEK；S2-PEEK；S+n-PEEK；Mn-PEEK試件上(每組3 個平行樣本，即n=3)。培養4 h后用PBS清洗3 次， 在4 ℃的條件下用4%的多聚甲醛固定30 min，再用PBS清洗3 次； 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 100%梯度酒精脫水、干燥、噴金。

2 結 果

2.1 PEEK材料表面形態、元素組成及含量

FE-SEM 觀察各組試件表面形貌，可見不同的微觀結構(圖 1)。空白對照組，低倍鏡(×500)下可見材料表面存在均勻一致且平行的打磨拋光痕跡，而高倍鏡(×10 000)下可見明顯的打磨痕跡。硫酸磺化5 min組(S-PEEK)，低倍鏡(×500)下觀察可見材料表面為均勻的多孔狀結構，高倍鏡(×10 000)下可見明顯的微米級3D篩孔狀結構。硫酸磺化10 min組(S2-PEEK)，低倍鏡(×500)下觀察可見材料表面為均勻的多孔狀結構與硫酸磺化5 min組未見明顯不同，但高倍鏡(×10 000)下觀察可見微米級3D篩孔狀結構較硫酸磺化5 min組明顯增大，而形態則十分相似。硫酸磺化+硝酸組(S+n-PEEK)與硫酸磺化5 min組極為相似。高錳酸鉀+磷酸組(Mn-PEEK)，低倍鏡(×500)下觀察可見材料表面較光滑，而高倍鏡(×10 000)下觀察可見與眾不同的花瓣樣結構。

表 1所示為各試件表面元素組成及元素含量。由表可見PEEK試件表面經處理后主要含有C、O、S等元素。濃硫酸磺化處理的PEEK都含有S元素，然而水浴加熱處理后S元素的含量各不相同。既往研究證明通過磺化反應，磺酸基團(-SO3H)會進入PEEK的碳氫骨架中[11]。各組中硫(S)元素的質量百分比：S1-PEEK(2.45±0.22)較S2-PEEK(3.48±0.16)的S含量偏低(P=0.000)，然而S含量卻高于S+n-PEEK(1.79±0.05,P=0.002)。S2-PEEK(3.48±0.16)的磺化結果提示， 盡管以相同的方法處理試樣， 表面硫(S)的含量隨著與濃硫酸反應時間的增長而增加。另外，磺化后的PEEK在硝酸(濃度約為68%～65%)作用5 min，可降低PEEK表面S的含量。通過高錳酸鉀+磷酸蝕刻作用，材料表面也會殘留如Mn、P等元素，但是其量基本可以忽略不計。

圖 1 各組材料微觀形貌圖(FE-SEM)Fig 1 Surface morphology of the various samples(FE-SEM)

表 1 XPS測定各組材料元素組成Tab 1 Elements composite of various sample detected by XPS

2.2 骨髓間充質干細胞粘附及偽足數量

未經化學處理的PEEK材材料表面光滑，細胞粘附數量偏少，鋪展情況尚可但有少量松散的細胞的偽足(圖 2A)。磺化5 min組、磺化10 min組以及磺化5 min+硝酸組處理后形成的3D篩孔狀結構，使得材料表面無論是細胞粘附數量還是絲狀偽足數量都優于純PEEK空白對照組(圖 2B～2D)。經高錳酸鉀+磷酸蝕刻的PEEK材料與對照組相比，細胞粘附數量基本相似，然而細胞偽足的數量要明顯優于對照組(圖 2E)。

圖 2 大鼠骨髓間充質干細胞在不同處理組材料表面培養4 h后的SEM圖Fig 2 SEM images of rBMSC grown for 4 h of culture on the material surface of each group

3 討 論

細胞粘附是細胞與材料相接觸的首要生理行為。已有研究表明，材料表面形貌對細胞粘附、增殖和分化起著至關重要的影響[12]。近期研究發現PEEK材料具有良好的力學性能，但其較差的表面生物性能不利于細胞的黏附[6-8,13]。目前，研究人員已經通過多種物理和化學方法對PEEK材料進行了表面處理[7-8,13-17]，均在不同程度上提高了PEEK材料的生物性能。根據PEEK材料的特性，本研究采用了操作較為簡單的化學酸蝕處理法，并取得了較好的結果。從電鏡結果可見經磺化的S1-PEEK和S2-PEEK材料表面均形成了極為相似的3D篩網狀結構，但S2-PEEK的篩網狀結構孔徑較S1-PEEK明顯增大，而S+n-PEEK與S1-PEEK的表面結構則未見明顯不同。該結果提示，隨著磺化時間的增加，PEEK材料表面的3D篩網狀結構也隨之增大，但磺化后的PEEK(SPEEK)與硝酸(濃度約為65%～68%)反應則不會改變材料表面形貌。而與對照組相比，盡管Mn-PEEK材料表面并未出現3D篩網狀結構，但其獨特的微米級花瓣樣結構，令其粗糙度明顯增加。目前普遍認為材料的三維形貌(大小、形狀、表面紋理)均會對細胞造成不同程度的影響[18-19]。進一步體外實驗發現，與空白對照組相比，經磺化的SPEEK無論是細胞的粘附數量還是偽足的伸展情況均顯示出較強的粘附能力。本研究發現不同磺化時間材料表面形貌會有所不同，但不同硫化時間是否對細胞生物學行為造成不同影響尚需要進一步實驗研究。

雖然本研究發現S-PEEK組在表面結構、細胞粘附及偽足數量均優于對照組，但也發現S-PEEK材料表面殘留較多的硫(S)，同時會引入磺酸基團(-SO3H)。既往研究證實，硫化混合物二氧化硫(SO2)及SO2衍生物會對人體細胞及DNA氧自由基產生不良影響[19]； 而水浴加熱的方式可去除材料表面殘余S。本研究發現通過相同水浴加熱法處理S2-PEEK(磺化10 min， 100 ℃水浴加熱4 h)其含S量較S1-PEEK(磺化5 min， 100 ℃水浴加熱4 h)仍會增加，考慮可能磺化10 min進入到PEEK的碳氫骨架的SO3H(磺酸基團)較磺化5 min要多所致。磺化后與硝酸反應再經過水浴處理后S+n-PEEK其含S量較S1-PEEK明顯減少，磺化后與硝酸(濃度約為68%～65%)作用5 min隨后水浴法處理可減少材料表面的S含量，操作方法簡單易完成，同時材料表面形貌不發生改變。經濃度約為68%～65%硝酸處理的S+n-PEEK材料對于骨髓間充質干細胞的初期粘附及偽足數量與磺化的SPEEK并沒有什么明顯的差異，對細胞的增殖、分化等生物學行為兩者會有什么差異目前尚不得而知。另外還發現，Mn-PEEK可得到粗糙表面同時不會殘留過多其他元素。綜上，初步發現SPEEK或S+n-PEEK及Mn-PEEK細胞粘附及偽足數量均較對照組PEEK材料均顯著增多，下一步將對細胞的增殖、分化等生物學行為進行深入研究，為新型PEEK材料廣泛應用于臨床奠定基礎。

4 結 論

通過不同化學法對PEEK材料進行處理，得到不同形貌S1-PEEK、S2-PEEK、S+n-PEEK、Mn-PEEK材料。處理后的PEEK材料表面可形成3D篩網狀或花瓣樣結構，同時增加細胞粘附且偽足數量顯著增多。表明通過化學法處理可改變PEEK材料表面特性進而提高其生物性能。