黃芪多糖的免疫調節作用對治療口腔扁平苔蘚的探討

馬田田 綜述 王秀梅 審校

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)是口腔黏膜的一種慢性非特異性炎性疾病，多數學者認為該疾病是T淋巴細胞介導的一種免疫相關性疾病，在口腔黏膜病中其復發程度僅次于復發性阿弗他潰瘍。OLP發展的特征為大多數情況下是由Th1/Th2免疫平衡與其他的CD4+T細胞亞群共同調節。

中藥黃芪根據中醫的理論其具有扶正補氣，利水退腫、托毒排膿、生肌等功效。而現代藥學的研究也已經證實，黃芪有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗氧化、降壓和較廣泛的抗菌作用。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)作為從黃芪中提取的一種主要生物活性成分，是目前臨床應用比較廣泛、研究較為深入的中藥成分之一。本文特綜述APS的免疫調節活性及其他藥理作用的研究新進展及可能應用于口腔扁平苔蘚的調節機制。

1 APS的組成及免疫活性

APS作為從傳統中藥黃芪中提取的一種有效成分是一類生物大分子，其成分包括葡聚糖和多種單糖。其中葡聚糖又有水溶性葡聚糖和非水溶性葡聚糖,分別是 α -(1→4)(1→6)葡聚糖和 α - (1→4)葡聚糖。其單糖種類主要包括 L-鼠李糖、 L-阿拉伯糖、 D-木糖、 L-木糖、 D-核糖、 L-核糖、 D-半乳糖、D-葡萄糖和 D-甘露糖等。Jiang等[1]從黃芪水中提取4 種黃芪多糖(APS1-APS4),提取后對每種多糖用20%、 40%、 60%、 80%的乙醇沉淀法進行純化，用硫酸-苯酚法測定所有糖含量，用用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)確定它們的分子量，用反相高效液相色譜分析柱前衍生色譜法測定其單糖組成，然后通過體外脾淋巴細胞增殖實驗評估APS的免疫生物活性。APS的4 種分子量分別為257.7 kDa、40.1 kDa，15.3 kDa和3.2 kDa。單糖組成分析表明，APS1僅包括葡萄糖，APS2包括所有阿拉伯糖，APS3包括鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，APS4包括半乳糖、阿拉伯糖。體外脾淋巴細胞增殖實驗證實APS2和APS3能有效刺激正常脾淋巴細胞在體外增殖。且APS2的濃度在6.25～800 μg/ml之間呈劑量依賴性。由此可證明分子量在15.2 kDa和40.1kDa之間組份為阿拉伯糖的APS有明顯的免疫活性。

2 APS對免疫細胞的調節作用

2.1 對樹突狀細胞的調節

耐受性樹突狀細胞(DCs)包含兩種細胞，一種是具有穩定表型的CD11clowCD45RBhigh，另一種是CD11chighDCs，而后者位于脾臟和淋巴結，特征是可以表達高水平的MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，并且CD11chighDC活化后可分泌大量的IL-12。APS可在體外誘導脾臟DCs轉化成CD11chighCD45RBlowDCs，因此猜測可使Th2轉化成Th1增強T淋巴細胞的免疫作用。為證明這一猜測Liu等[2]將小鼠脾臟制成單細胞懸液采用磁珠分選方法分離DCs, CD11chighCD45RBlowDCs，CD11clowCD45RBhighDCs和CD4+T細胞，采用ELISA和流式細胞術等實驗方法，得出用APS誘導后CD11chighCD45RBlowDCs細胞百分率明顯升高，且CD11clowCD45RBhighDCs與IL-12的產生和APS的刺激呈現劑量依賴關系。證明了APS可導致脾臟DCs分化成CD11chighCD45RBlowDCs繼而使Th2轉化成Th1，增強T淋巴細胞的免疫功能。

2.2 對T淋巴細胞的調節

CD4+CD25highTreg的平衡可通過抑制自身反應性T細胞和癌細胞免疫反應阻止自身免疫性疾病的發生。相關研究證實APS對CD4+CD25+Treg細胞的生長和增殖的抑制作用呈劑量和時間依賴性，而這種抑制作用可能是通過使失衡的細胞因子恢復和使局部肝癌微環境中的FOXp3減少來實現的，CXC類趨化因子SDF-1在募集Treg細胞到肝癌腫瘤微環境中發揮著重要催化作用，故猜測APS可能通過CXCR4/CXCL12通路阻斷SDF-1及其受體抑制Treg細胞轉移[3]。

APS可以降低系統性紅斑狼瘡患者血清中IFN-γ和 IL-10的水平，改善系統性紅斑狼瘡患者的Thl/Th2細胞比例失調[4]。而且APS沒有激素長期治療的副作用，這為自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。

Th17細胞是一種以分泌 IL-17為特征的CD4+T輔助細胞亞群[5]，主要產生IL-17A和 IL-17F，以及少量的腫瘤壞死因子(TNF)和IL-6，其中IL-17A是Th17細胞發揮免疫調節作用的主要效應因子。IL-23作為一種重要的促炎因子可以促進激活的記憶細胞產生IL-17，使Th17細胞得生存。郭艷等[6]通過制備大鼠潰瘍性結腸炎模型，于造模后第3 天給予APS溶液和柳氮磺胺吡啶(SASP)混懸液的實驗方法，發現APS組大鼠腸黏膜腺體增生修復明顯，肌層增厚，炎性細胞浸潤不明顯，且APS組與SASP組大鼠血清中IL-23、IL-17、TGF-β含量均顯著降低，其中APS組降低更明顯，證明APS對IL-17有調節作用，并猜測APS可能通過調節大鼠血清中 IL- 23、TGF-β的表達來調節 Th17 細胞，以減輕腸黏膜炎癥損傷。

2.3 對巨噬細胞的調節

APS能促進巨噬細胞內TNF-α，GM-CSF和NO的產生，從而提高巨噬細胞的免疫防御能力[8]。巨噬細胞作為免疫效應細胞，參與免疫系統的調節，是機體免疫系統中重要成分之一，且主要為非特異性免疫。這些細胞的功能正常關系到免疫應答的抗原呈遞過程和抗原清除能力。因此，通過檢測巨噬細胞對異物顆粒的吞噬能力可直接評價吞噬細胞自身的功能，也可以間接評價免疫應答能力。研究[7]發現免疫抑制模型小鼠給予APS后巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數明顯升高，說明APS可顯著提高小鼠的免疫功能。由此可知，APS對免疫抑制模型小鼠巨噬細胞的吞噬功能具有明顯增強作用。

亦有研究發現APS可明顯增加巨噬細胞內蛋白激酶C(PKC)的活性和細胞內第二信使(NO,cAMP, DAG, IP3, Ca2+)的濃度，而且經APS作用后巨噬細胞內NF-κB的mRNA和蛋白水平明顯增加，但經Ca2+抑制劑NiCl2作用后卻明顯降低，同時TNF-α和IL-6也顯著降低[9]。證明Ca2+-cAMP 和 TLR4/NF-κB 信號通路參與了部分APS在巨噬細胞內的免疫調節。

3 抗炎作用

3.1 通過抑制NF-κB信號通路

APS可明顯抑制NF-κB信號通路活性。Tao Luo等[10]將小膠質細胞BV2經LPS刺激后加入不同濃度的APS培養24h，結果發現TNF-α和IL-1βmRNA的表達水平呈劑量依賴性降低，IκB降低70%，磷酸化的NF-κBp65蛋白水平亦降低。NF-κB在胞漿中結合抑制劑IκB，IκB蛋白的降解是NF-κB激活的一個重要步驟。證明了APS可顯著抑制LPS誘導的IκB的降解，從而抑制NF-κB的活化和轉導。此外，亦有人通過在小鼠腹腔注射APS，檢測到NF-κB通路的標志性因子NF-κBp65、p-NF-κB p65 及 p-IκBα表達明顯降低[11]，亦證明APS可明顯抑制 NF-κB信號通路活性。

3.2 通過抑制MAPKs和PKB信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括p38、JNK和ERK，已被證實參與了氧化應激和促炎信號級聯放大。PI3K/PKB調節細胞的活化、炎癥反應和細胞凋亡。PI3K通路激活后可通過抑制細胞凋亡保護心臟功能，抑制p38MAPK減輕細胞炎癥反應[11]。先前研究證明，PI3K/PKB和MAPK通路是APS必不可少的靶點。最近研究發現ERK、JNK、p38和PKB激酶被LPS刺激后磷酸化，與它們在介導炎癥中的關鍵作用一致；然而在APS作用后僅有pPKB被選擇性抑制，故猜測這種差異的原因可能主要是由于個體的PKB基因表達與細胞類型和刺激的變化有關。 (MAPKs)信號通路可通過IκB的降解促進NF-κB的激活。Ye等[12]研究顯示APS通過抑制基底樣乳腺癌細胞株MDA-MB-468的增殖下調PKB的磷酸化表達。如圖 1在BV2小膠質細胞中，LPS刺激激活TLR4作用于MAPKs、PI3K/PKB， 兩者發送信號到NFκB-IκB復合物， NFκB-IκB復合物活化釋放NFκB入核，NFκB在釋放入核時即介導參與炎癥反應的基因轉導，APS選擇性阻止LPS誘導的PKB磷酸化從而抑制IκB降解，抑制NFκB磷酸化，降低小膠質細胞中NO、PGE2、TNF-α和IL-1β的產生。

圖 1 APS對LPS介導的BV2小神經膠質細胞炎癥反應的影響

4 抗凋亡作用

活性氧(ROS)水平的增加在細胞凋亡的發展中起著關鍵的作用，由ROS引起的氧化應激通過氧化線粒體膜和線粒體的膜電位去極化產生大量ROS啟動或促進細胞凋亡和衰老[13]，ROS參與了鐵過載誘導的細胞凋亡和器官老化，鐵過載可通過細胞內ROS的增加引起骨髓間充質干細胞(BMSCs)的凋亡[14]；APS可降低由沙苑子黃酮(FAC)引起的BMSCs線粒體中明顯增加的ROS及細胞凋亡；提高干細胞調控因子Nanog，Sox2和Oct4的mRNA表達水平。因此APS通過阻止線粒體內ROS的聚集進而明顯抑制由FAC誘導的因鐵過載引起的BMSCs凋亡、衰老和多功能性降低。

5 其他作用

5.1 殺傷腫瘤細胞

Huang等[15]在肝癌(HCC)細胞系H22細胞中分別用CCK-8和流式細胞術等實驗方法檢測APS對其的潛在作用，結果與正常肝組織相比發現HCC組織中Notch1的mRNA和蛋白表達明顯上調，且用APS作用后H22細胞Notch1的mRNA和蛋白表達水平的降低呈濃度依賴性，用siRNA敲擊的Notch1可通過降低凋亡抑制基因Bcl-2的表達和增加促凋亡基因BAX的表達來降低H22細胞的活性，顯著提高H22細胞的凋亡。因此，Notch1可調節HCC細胞的生存和轉移能力，APS即通過抑制Notch1的表達誘導HCC細胞凋亡。

5.2 抗病毒

通過三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉(STMP-STPP)法和氯磺酸-吡啶方法來分別修飾APS可得到其磷酸(pAPS)和硫酸(sAPS)形式[16]，通過觀察APS、pAPS和sAPS在細胞和血液的病毒增殖過程的抗-DHAV增殖作用，證明了pAPS在整個病毒增值過程中抑制DHAV增值的作用顯著強于APS和sAPS，并且能顯著提高33.5%的生存率，降低血液和肝臟病變部分的DHAV顆粒效價。因此，pAPS可有較強的抗-DHAV活性。

6 OLP發病機制涉及的免疫細胞

與OLP的發病機制相關的細胞主要是：角質細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、樹突細胞(DC)、Treg細胞等。DC通過抗原反應激活T細胞，在免疫反應中，CD4+T淋巴細胞可激活B淋巴細胞、巨噬細胞及CD8+T淋巴細胞。這些細胞可分化為3 個不同的細胞系：Th1、Th2 以及Th17。Xie等[17]的研究顯示，OLP患者Th1和Th17細胞的比例及血清中IL-17的含量較正常水平顯著升高，提示Th17是OLP促炎癥細胞因子，Th17系細胞及其相關細胞因子在OLP發病中發揮重要作用。在OLP患者中CD8+T細胞的滲透主要發生在表皮內、基底膜破壞區及毗鄰基底角質細胞。抗原識別、表達的基礎是通過角化細胞促進趨化因子激活，最終通過活化穿孔蛋白或顆粒酶，使Fas L受體表達，從而促進 TNF-α分泌，促進角質細胞發生凋亡。在OLP患者外周血中CD4+CD25highT 細胞、CD4+Foxp3+T細胞水平較正常對照組明顯升高；CD4+CD25highT細胞與CD4+Foxp3+T細胞水平存在正相關性，CD4+CD25+Foxp3+T細胞與CD4+Foxp3+T細胞水平存在明顯正相關性[18]；Wang等[19]亦發現OLP患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達明顯增加，猜測Treg細胞的表達升高可能是OLP的發病因素之一。

7 展 望

近年來，盡管OLP在治療上取到了良好療效，但OLP的復發率仍然很高，而且激素長期治療的的副作用對患者的日后生活也造成了極大的困擾。APS作為一種研究較熱的中藥成分，有顯著的免疫活性，其主要作用可使脾臟DCs分化成CD11chighCD45RBlowDCs，繼而使Th2轉化成Th1，增強T淋巴細胞的免疫功能；改善失衡的Th1/Th2細胞比例；調節Th17細胞及相關細胞因子；抑制Treg細胞的免疫抑制作用；提高巨噬細胞的吞噬功能；通過NF-κB及MAPKs和PKB信號通路發揮抗炎作用；亦可通過阻止ROS的聚集防止因鐵過載引起的BMSCs凋亡、衰老、多功能降低。此外，APS還有抗腫瘤、抗病毒作用。TLRs/NF-κB信號通路的激活現已被本課題組證實參與了OLP的炎癥反應及其病理過程；且TLRs/NF-κB信號通路中跨膜信號蛋白TLR4和胞內轉錄因子NF-κBP65基因的表達水平隨OLP細胞模型炎癥反應程度的加重而升高[20]，TLR-4及NF-κBP65在OLP的病損形成中具有重要意義[21]。細胞凋亡異常及細胞免疫紊亂等在OLP的發病機制中亦具有非常關鍵的作用。因此，APS在OLP中的作用有待于研究證實。我們更應該對該中藥進行深入的研究，以改善Th1/Th2細胞比例失衡，通過NF-κB信號通路抗炎，抑制細胞凋亡為治療靶點，使之成為根治OLP的藥物，造福人類。