CCND1基因多態性與胃癌易感性的關系

高琳琳 宋 光

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第二大致死因素[1]。據全國腫瘤登記中心統計數據顯示，2015年中國癌癥新增429.16萬例，死亡281.42萬例，其中胃癌67.91萬例，在各類癌癥中占比15.82%；因胃癌死亡49.8萬例，在各類癌癥中占比17.69%，居發生率和病死率的第2位[2]。胃癌是一種多種病因的復雜疾病，其病因包括幽門螺桿菌感染、遺傳因素和某些環境飲食因素，比如食用含有致癌硝酸鹽的腌制食品、生活方式、煙草、乙醇等。在影響胃癌發病的多種因素中，遺傳易感性仍然是當前研究的熱點。遺傳易感性的不同主要來自于基因的多態性，其中單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最常見的變異。SNP是決定人類疾病易感性的核心信息，它能夠更加真實地體現不同人群個體之間的遺傳差異，因此被認為是新一代的遺傳標記。

腫瘤被認為是一種細胞周期性疾病，現已經證明細胞周期調控似乎在幾種類型癌癥的細胞增殖、分化和細胞凋亡中起關鍵作用，它可以影響線粒體代謝、通過DNA調節轉錄因子信號轉導、染色體不穩定性的誘導等[3]。CyclinD家族(細胞周期蛋白)是細胞周期的正調節器，其中最重要的是細胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)。CCND1貫穿了整個細胞周期，調節了細胞周期不同階段的進展，在細胞周期中起到特定作用。它通過與周期素依賴性蛋白激酶4或6(CDK4或CDK6)結合形成復合體，并作為其調節亞基起作用，促進細胞從G1期進入S期，其活性是從G1向S期轉變所必需的[4]。編碼CCND1的基因,即CCND1基因,被稱為原癌基因，它作為有絲分裂的信號傳感器，通常在腫瘤細胞中的數量上發生改變，其基因擴增和蛋白質過度表達使細胞周期縮短，從而導致腫瘤細胞自主無限性增殖[5～7]。

CCND1基因存在多態性位點，即具有單核苷酸多態性，其中研究最多的是在核苷酸870(242位密碼子)處的G/A多態性。許多研究表明，CCND1基因多態性與多種腫瘤有相關性，包括乳腺癌、結直腸癌等，但研究結果不盡相同，且與胃癌關系的研究較少[8，9]。因此，本研究采用病例對照研究，選取CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129多態性位點，探討其與胃癌發生、發展的關系，為將來胃癌的早期診斷、篩查及治療提供線索。

對象與方法

1.研究對象：收集2016年10月～2017年10月期間在哈爾濱醫科大學附屬第三醫院就診的胃癌患者292例(病例組)，所有患者均經臨床和病理證實確診為胃癌，均未進行過放療和化療，且為原發性胃癌，排除繼發性或復發性腫瘤及其他惡性腫瘤。選取同期哈爾濱醫科大學附屬第一醫院體檢中心的健康體檢者298例為對照組，既往均無腫瘤遺傳病史，對照組與病例組患者的性別、年齡情況相匹配，兩組人群無血緣關系。

2.方法：(1)血液基因組DNA提取:抽取研究對象外周靜脈血2ml，采用天根生物技術有限公司提供的血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，將提取的DNA于-20℃冰箱保存。(2)PCR擴增目的基因片段:根據CCND1基因組序列設計CCND1基因 rs9344、rs7177、rs1944129位點PCR引物。rs9344引物序列：上游引物:5′-GAACCTGAGGAGCCCCAACAAC-3′，下游引物:5′-GGCACTAGGTGTCTCCCCCTGT-3′。rs7177引物序列：上游引物：5′-AGGTGGACCTGGCTTGCACAC-3′，下游引物：5′-AAAACAACCAACAACAAGGAGAATGAA-3′。rs1944129引物序列：上游引物：5′-CCCCATTGGCTCATGCTAATTC-3′，下游引物：5′-GATTTATGGGGCCCGGAGCTAT-3′。PCR反應體系(20μl)包含1×HotStarTaq buffer, 3.0mmol/L Mg2+, 0.3mmol/L dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA和1μl多重PCR引物。PCR擴增條件：95℃預變性5min后，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次，最后72℃10min，4℃保溫。進行多重PCR產物純化，用連接酶連接擴增產物。(3)DNA測序:取0.5μl 稀釋后的連接產物，采用ABI3730XL測序儀進行測序。

結 果

1.兩組一般資料比較：292例胃癌患者中，其中男性207例，女性85例；298例對照組人群中，其中男性203例，女性95例。病例組患者的平均年齡為56.93±10.19歲，對照組人群平均年齡為55.75±11.14歲。胃癌患者和對照組年齡和性別的比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，兩組人群具有可比性，詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗：經過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，兩組患者基因型的觀察值和期望值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點基因型頻率符合遺傳平衡定律，所選樣本具有代表性,詳見表2。

表2 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

3.CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多態性與胃癌易感性的關系：病例組和對照組CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點的基因型頻率，詳見表3。結果顯示，病例組與對照組比較，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點基因型分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多態性與胃癌易感性的關系[n(%)]

討 論

胃癌是當今世界上最常見的危害全球人類健康的惡性腫瘤之一，當今社會經濟和醫療水平逐步發展以及人類食物多樣性大大增加，然而胃癌在全世界范圍內發生率和病死率始終居高不下。胃癌的初期癥狀不甚明顯，初期診斷率較低，多半患者自覺較重癥狀來醫院就醫時已經到了中期或晚期。胃癌的治療手段包括手術治療、化療和放療，雖然這些治療措施顯著提高了患者的生存率，但是預后仍較差，總體5年生存率僅為30%[10]。因此尋找到特異性生物標志物，可以幫助胃癌的早期診斷、篩查及藥物靶向治療等。目前有大量的研究證明遺傳基因的多態性在胃癌的發生、發展進程中關聯密切，其中SNP是能夠作為新一代遺傳學標記的突變形式。

CCND1 基因位于1lql3 染色體，包括5個外顯子，4個內含子，長約15kb，編碼細胞周期蛋白D1[11]。細胞周期蛋白D1是充當真核細胞周期的關鍵控制元件的蛋白質，它們的蛋白質水平在整個細胞周期中顯著且周期性地改變。每個細胞周期蛋白表現出特征性表達和降解模式，這有助于有絲分裂事件的時間協調。細胞周期蛋白D1與CDK4或6結合，促進細胞從G1期向S期轉化，其主要作用是能夠磷酸化并滅活視網膜母細胞瘤蛋白(Rb蛋白)，因為Rb蛋白通過其抑制E2F轉錄活性的能力來抑制細胞周期進程[5]。在G1期，細胞需要做出決定是否進入另一個分裂，或者退出細胞周期進入靜止期(G0)響應細胞外信號，細胞周期蛋白D1作為有絲分裂信號傳感器，表現為對許多促有絲分裂信號的延遲早期反應，迫使細胞從G0期進入增殖周期。除了CDK依賴的功能之外，現在積累的大量證據表明，細胞周期蛋白D1也可以作為類固醇激素受體如雌激素受體的轉錄輔因子，除了腫瘤的形成，細胞周期蛋白D1還可以通過惡性細胞與宿主環境之間的相互作用在侵襲性和轉移表型中起關鍵作用[11]。此外，細胞周期蛋白D1通常在血管生成和線粒體功能中起調節作用，這表明，細胞周期蛋白D1表達可能有助于腫瘤的侵襲性和轉移潛能。

細胞周期蛋白D1在幾種人類腫瘤中過度表達，其作用機制包括染色體易位、基因擴增和蛋白質水解的破壞等[11]。現在已經在公共SNP數據庫(dbSNP)中鑒定并分類了超過250個跨越CCND1的SNP，其中CCND1G870A(rs9344)多態性位點在腫瘤中研究最多[12]。CCND1 870G/A(rs9344)SNP分為GG型、GA型和AA型，可以調節調節mRNA的剪接頻率，其產生2個轉錄物，A等位基因產生轉錄物b，G等位基因產生轉錄物a，轉錄物編碼具有功能性細胞周期蛋白盒的蛋白質(氨基酸55～161)。然而，轉錄物b缺少負責CCND1降解的PEST序列，這可能使轉錄物b編碼的蛋白質比轉錄物a有更長的半衰期，因此具有CCND1 870A變體的個體更有可能繞過G1～S細胞周期檢查點，從而導致癌癥細胞異常增殖[13]。然而，也有研究表明G等位基因也可以產生轉錄物b，A等位基因也可以產生轉錄物a，這說明A等位基因可能不是轉錄物b生產的普遍需要。

Kuo等[14]通過對358例胃癌患者與358例健康者的研究中發現，CCND1rs9344位點多態性與胃癌風險相關，攜帶AG和GG基因型的受試者與CCND1rs9344上攜帶AA基因型的受試者相比具有較低的胃癌風險，因此CCND1 rs9344的AG和GG基因型可能是胃癌的早期發現和預測的保護性標志物。Kuo等[16]還調查了CCND1G870A基因型與個人吸煙狀況對胃癌風險的相互作用，發現兩者之間有協同作用，并可能增加臺灣地區民眾胃癌的風險。Tahara等[15]研究表明CCND1 G870A基因多態性與胃癌CpG島啟動子甲基化高風險相關聯，這是第一份顯示CCND1多態性與胃癌高甲基化狀態之間潛在關聯的報告。一項Meta分析評估了CCND1rs9344多態性與胃癌風險之間的關系，他們發現亞洲人群中CCND1rs9344多態性與胃癌發生之間無相關性，但可能增加高加索人的胃癌發病風險[16]。這表明基因多態性可能存在地域差異，可能與人群種族及生活方式的不同有關。

關于CCND1 rs7177位點多態性，有研究表明，它與腎癌、頭頸部腫瘤等發病有關[3，17]。Petkevicius等[18]探究了歐洲人CCND1 rs7177 SNP與胃癌風險之間的關系，未發現兩者之間的相關性，這與本研究結果是一致的。對于CCND1 rs1944129位點，Xue等[3]證實了其多態性與腎癌相關，但其與胃癌易感性之間的關系未見有相關報道。本研究探討了CCND1 rs1944129位點多態性與胃癌的關系，結果顯示：病例組中rs1944129位點基因CC型、CT型、TT型出現的頻率分別為3.36%、35.57%、61.07%，對照組中基因型分別為5.14%、29.79%、65.07%，兩組基因型差異無統計學意義(P>0.05)，研究結果表明rs1944129位點與胃癌的發生、發展可能無相關性。

本研究采用以醫院為基礎的病例對照研究，分析了CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位點多態性與胃癌發病風險的關聯。研究結果顯示，CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位點多態性與胃癌的發病風險均無明顯相關性(P>0.05)。其原因可能是本研究樣本量較小，在選擇研究對象時有許多限制，這可能使相關性的統計效力存在一定的局限性，而且不能完全排除可能與特定基因型相關的受試者選擇偏倚的可能性。另外，基因與環境等多種因素的相互作用、種族地域差異、個體的遺傳異質性等也可能是其影響因素。CCND1基因多態性與胃癌易感性的關系尚需進一步驗證，需要更大樣本、大規模和精心設計的研究。