LncRNA H19在食管癌組織中的表達及其與細胞轉移的關系

朱坤，徐楠楠，韓振東，白學義

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 心胸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾市第一醫院 檢驗科，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，2015年我國食管癌新發47.79萬例，死亡37.50萬例，分別居全部惡性腫瘤的第3和4位，嚴重威脅人們的生命健康[1]。食管癌早期癥狀隱匿、進展迅速且侵襲性強，多數患者確診時已處于晚期，導致患者總體生存率僅為20%左右[2]。因此，明確影響食管癌發生、發展的確切機制對食管癌的早期診斷及靶向藥物開發具有重要意義。近年來發現長鏈非編碼RNA H19（LncRNA H19）參與多種惡性腫瘤的進展[3]。本研究通過體外實驗探究LncRNA H19在食管癌中的表達情況及其與食管癌轉移的關系，為尋找食管癌臨床診治的新靶標提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月—2017年3月齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院心胸外科收治的72例食管癌患者的腫瘤組織及相應癌旁組織（距離原發灶＞5 cm），取材后用液氮保存并標記。患者均為初發食管癌，術前未行放化療、免疫治療等抗腫瘤治療。其中，男性41例，女性31例；年齡33～75歲，平均（54.9±13.1）歲；高、中分化48例，低分化24例；TNM分期Ⅰ期13例，Ⅱ期36例，Ⅲ期23例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移29例。本研究中患者均簽署知情同意書。

1.2 人食管癌細胞TE1的培養及細胞系構建

人食管癌細胞TE1（美國ATCC公司）用RPMI-1640（美國Gibco公司）+10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國Gibco公司）培養。人腎上皮細胞系HEK293T（美國ATCC公司）是一種工具細胞，使用DMEM（美國Gibco公司）+10%FBS培養，于ACB-6A1超凈工作臺（新加坡Esco公司）中嚴格無菌操作，37℃、5%二氧化碳CO2常規3111生化培養箱（美國Thermo公司）中培養。TE1細胞在其中進行慢病毒的包裝后收集病毒懸液。利用脂質體Lipofectamine 2000（美國Thermo公司）轉染表達LncRNA H19的慢病毒載體及空白載體（上海吉凱基因化學技術有限公司）人食管癌細胞TE1中[4]。收集含LncRNA H19慢病毒載體和空白載體的病毒懸液。實驗組采用 RPMI-1640+10% FBS 與含 LncRNA H19慢病毒載體的懸液1∶1混合培養3 d；對照組采用RPMI-1640+10% FBS與含空白載體的懸液1∶1混合培養3 d，期間加入2μl聚凝胺（美國Sigma公司），1μg/ml嘌呤霉素篩選細胞（美國Sigma公司）至細胞穩定生長。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應

從液氮中取出組織標本，取適量組織進行研磨，1 ml RNAiso Plus（日本 TaKaRa 公司）重懸組織 ；收集兩組6 cm培養皿中融合度＞80%的對數生長期細胞，同樣1ml RNAiso Plus重懸細胞。將準備好的組織或細胞樣本用Trizol法抽提總RNA，用逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）將2μg RNA逆轉錄為相應的cDNA，稀釋引物至 100 nmol/ml，LncRNA H19 正向引物：5’-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3’；反向引物：5’-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3’；β-actin 正向引物：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’；反向引物：5’-GCTGATCCACATCTGCT-3’。 與 Sybr Green 熒光染料（日本TaKaRa公司）配置，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 系 統（Applied Biosystems 7500）進行熒光定量分析，β-actin作為內參基因，用2-△△Ct法計算各個樣本LncRNA H19的相對表達量，設置3個重復孔，計算其均數和標準差。

1.4 Transwell侵襲及遷移模型

將50μg/ml基質膠（美國Corning公司）與RPMI-1640培養基1∶8混合，均勻平鋪至Transwell小室（美國Corning公司），于生化培養箱中孵育4 h，用RPMI-1640培養基重懸兩組細胞，細胞計數儀（美國Bio-Rad公司）檢測細胞懸液濃度，調整細胞濃度至1×106個/ml，取100μl加至鋪基質膠的Transwell小室中央，同樣加入100μl細胞懸液于未鋪基質膠的Transwell小室，分別作為Transwell侵襲及遷移模型。將兩組細胞于生化培養箱中培養24 h，棉球拭去上室面細胞，PBS洗小室3次，10%甲醇固定10 min，0.1%結晶紫染色30 min，DM1000光學顯微鏡（200倍，德國Leica公司）下細胞計數，取5個隨機視野，計算其均值和標準差。

1.5 Western blotting檢測

收集兩組6 cm培養皿中融合度＞80%的對數生長期細胞，1 ml細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）+1 mmol蛋白酶抑制劑（美國Amresco公司）重懸細胞，冰上裂解細胞1 h，4℃低溫高速離心機（德國 Eppendorf公司），13 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測總蛋白濃度。取40μg上樣量行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V穩壓轉膜，1∶1 000β-肌動蛋白（SAB3500350，美國Sigma公司）、基質金 屬 蛋 白 酶 -2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）（M6184，美國Sigma公司）及基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）（M5177，美國 Sigma 公司）抗體室溫孵育相應目的條帶2 h，PBS洗膜3次，1∶1 000羊抗兔IgG抗體（R1131，美國Sigma公司）孵育1 h，PBS洗膜3次。采用ECL發光液（美國Millipore公司）孵育條帶30 s，化學發光成像系統（Invitrogen E-Gel Imager，美國 Thermo 公司）曝光目的條帶并掃描條帶灰度值。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數間距M（P25，P75）表示，比較用t檢驗或秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組織及癌旁組織中LncRNA H19的比較

qRT-PCR結果顯示，實驗組組織中LncRNA H19表達水平為0.214（0.282，0.132），對照組組織中為0.103（0.139，0.055），經秩和檢驗，差異有統計學意義（Z=1.375，P=0.000），實驗組高于對照組。見圖1。

圖1 食管癌組織及癌旁組織中LncRNA H19的比較

2.2 食管癌組織中LncRNA H19表達水平與患者臨床病理特征的關系

不同TNM分期、淋巴結轉移率及組織分化程度患者的LncRNA H19高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而不同的年齡、性別、腫瘤大小比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 兩組LncRNA H19蛋白表達水平比較

實驗組LncRNA H19蛋白表達水平為（0.835±0.117），對照組為（0.336±0.089），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.277，P=0.004）。見圖 2。

表1 不同影響因素患者的LncRNA H19高表達率比較

圖2 兩組LncRNA H19蛋白表達水平比較 （±s）

2.4 兩組細胞侵襲及遷移能力比較

Transwell侵襲模型顯示，實驗組細胞侵襲細胞數（59.28±9.57）個，對照組（37.44±6.26）個，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.271，P=0.003）。實驗組細胞遷移細胞數（143.10±17.92）個，對照組（68.16±10.35）個，經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.097，P=0.000）。見圖 3。

圖3 兩組細胞侵襲及遷移能力比較 （×200）

2.5 兩組MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

Western blotting結果顯示，實驗組MMP-2相對表達量為（0.383±0.049），對照組為（0.147±0.030），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.433，P=0.001）；實驗組MMP-9相對表達量為（0.724±0.095），對照組為（0.408±0.063），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.801，P=0.003）。見圖 4。

圖4 兩組MMP-2、MMP-9蛋白的表達

3 討論

LncRNA是一類轉錄長度＜200 bp的非編碼RNA，可通過多種表觀遺傳機制調控基因的表達，在機體內發揮重要的生物學作用。LncRNA H19作為LncRNA中的一員，參與哺乳動物早期胚胎發育，并在組織器官成熟后表達下調。近年有研究顯示，其在多種惡性腫瘤中表達重新上調，且參與惡性腫瘤的發生、發展，包括非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌及結直腸癌等：①LncRNA H19高表達于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其表達與患者預后總生存時間呈負相關，另外LncRNA H19可促進NSCLC細胞c-Myc的表達，進而介導細胞的惡性增殖[5-6]。②LncRNA H19在乳腺癌組織中高表達，其可通過下調E3泛素連接酶家族c-Cbl和Cbl-b的表達，抑制表皮生長因子受體泛素化過程，促進其穩定性，介導乳腺癌細胞增殖及侵襲能力[7]。③LncRNA H19高表達于胃癌組織，且可促進胃癌細胞體內外的增殖轉移能力，胃癌患者組織及血漿中LncRNA H19的高表達均可提示患者預后不良[8-9]。④LncRNA H19還可通過介導結直腸癌細胞上皮間充質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT），促進腫瘤組織體內外生長，同時LncRNA H19還可作為結直腸癌進展及患者不良預后的標志物[10-11]。⑤LncRNA H19還可通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路，下調E-鈣黏蛋白的表達，進而增強膀胱癌細胞增殖及侵襲能力[12]。上述研究均提示LncRNA H19可作為原癌基因發揮作用，但其在食管癌中表達的臨床意義及對食管癌細胞轉移能力的影響尚不明確。

本研究顯示LncRNA H19在食管癌組織中高表達，提示LncRNA H19可能參與食管癌的發生、發展，同時LncRNA H19的表達與患者組織分化、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，高表達LncRNA H19的患者傾向于較低的組織分化程度，提示LncRNA H19對食管癌惡性轉化可能存在促進作用，較高的TNM分期及淋巴結轉移率表明LncRNA H19可能促進食管癌細胞的局部淋巴結轉移。為進一步明確LncRNA H19對食管癌細胞轉移能力的影響，筆者在TE1細胞中外源性上調LncRNA H19的表達，發現細胞侵襲及遷移能力均增強。MMP-2、MMP-9為金屬基質蛋白酶家族成員，兩者可相互作用，共同促進細胞外基質的降解，且可通過促進細胞EMT的發生，介導細胞活性的增強。有研究顯示，MMP-2及MMP-9在多種惡性腫瘤中高表達，在介導腫瘤細胞的侵襲、遷移的過程中發揮重要作用[14-15]。筆者對LncRNA H19促食管癌細胞轉移的相關機制進行探究，發現上調LncRNA H19后，MMP-2、MMP-9表達升高，提示LncRNA H19可通過促進MMP-2、MMP-9的表達，介導細胞外基質模型基底膜的降解，進而導致細胞侵襲能力增強，促進細胞活性，增強細胞遷移能力。

綜上所述，本研究明確LncRNA H19在食管癌組織中的高表達水平及其對食管癌細胞轉移的促進作用，但LncRNA H19與食管癌體內外增殖的關系尚不清楚。筆者擬在接下來的研究中擴大臨床標本數量，并通過體外實驗明確其與食管癌體內外生長的關系，為LncRNA H19的食管癌診斷試劑盒及靶向藥物研發提供新依據。