HMGB1和HIF1a在乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)及意義

龔龍，易春華，周明，鄭建偉

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北 荊州 434020；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常見(jiàn)的甲狀腺癌，腫瘤細(xì)胞分化程度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC預(yù)后的重要因素[1-2]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要影響因素，而缺氧是眾多實(shí)體腫瘤微環(huán)境的顯著特點(diǎn)[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTC組織及其癌旁組織中缺氧誘導(dǎo)因 子 1a（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1a） 和高遷移率族蛋白 1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）表達(dá)情況，分析HIF-1α和HMGB1與PTC臨床病理特征的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步研究HMGB1和缺氧在PTC細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制提供臨床證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月—2017年10月經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院甲狀腺外科術(shù)后確診的120例患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織石蠟標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)HE染色證實(shí)為PTC。其中，男性36例，女性84例;年齡31～76歲，平均46.9歲。患者術(shù)前均未行放化療，統(tǒng)計(jì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及甲狀腺癌臨床分期情況。其中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移82例。按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)聯(lián)盟的TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期77例，Ⅲ、Ⅳ期43例。

1.2 試劑

兔抗人HMGB1及HIF-1α多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)ABCAM公司，兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒[北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（SP-9001）]，DAB顯示劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)

切取石蠟切片，每張切片厚約5μm，采用SP法檢測(cè)PTC組織及相應(yīng)癌旁組織中HIF-1α、HMGB1蛋白的表達(dá)（HIF1a一抗工作濃度為1∶100；HMGB1一抗工作濃度為1∶100）。所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，試劑公司提供的陽(yáng)性著色圖片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)REMMELE等[4]提出的免疫反應(yīng)評(píng)分（immunoreactive score, IRS）進(jìn)行染色反應(yīng)的評(píng)價(jià)：IRS=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分率。染色強(qiáng)度0為陰性，1為弱，2為中度，3為強(qiáng)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率0%為陰性，＞0%～10%為1；＞10%～50%為2；＞50%～80%為3；＞80%為4。IRS評(píng)分0～12分，評(píng)分＞4分定義為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；變量之間的相互關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和HMGB1蛋白在PTC及其癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示，PTC組織中，HMGB1陽(yáng)性呈棕色或褐色，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（見(jiàn)附圖A）。而癌旁組織中，HMGB1主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表達(dá)較PTC組織減少，且染色減弱（見(jiàn)附圖B）。同樣地，PTC組織中HIF1a陽(yáng)性呈棕色或褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（見(jiàn)附圖C）。而癌旁組織中，HIF1a主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表達(dá)較PTC組織減少，且染色減弱（見(jiàn)附圖D）。

附圖 HMGB1、HIF1a在PTC及其癌旁組織中的表達(dá) （SP法×200）

2.2 PTC組織中HMGB1與HIF1a表達(dá)的相關(guān)性

HMGB1在PTC組織及癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.0%和35.0%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.067，P=0.005），PTC組織陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織；HIF1a在PTC組織及癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為59.2%和40.8%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.630，P=0.002），PTC組織陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織。相關(guān)性分析顯示，PTC組織標(biāo)本中HMGB1與HIF1a的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 PTC組織中HMGB1、HIF1a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

HIF1a和HMGB1在不同腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

表1 PTC組織中HMGB1與HIF1a表達(dá)的相關(guān)性 例

表2 PTC組織中HMGB1、HIF1a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

組織缺氧是多數(shù)實(shí)體腫瘤常見(jiàn)的病理生理特征，越來(lái)越多人認(rèn)識(shí)到其在腫瘤進(jìn)展的不同階段中起關(guān)鍵作用[5]。腫瘤對(duì)缺氧的適應(yīng)主要受缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α和HIF-2α）的調(diào)節(jié)，HIF-1α與腫瘤啟動(dòng)子有關(guān)，被認(rèn)為是一個(gè)促腫瘤因子，而HIF-2α則被證實(shí)是腫瘤抑制基因[6]。迄今為止，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在卵巢、食管、頭頸部、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌及口腔上皮等腫瘤中過(guò)表達(dá)[7-11]。此外，最近一些研究檢測(cè)了甲狀腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)[12-13]。然而，HIF-1α與炎癥效應(yīng)因子在PTC的發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系研究甚少，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

HMGB1蛋白是一種豐富的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。其能穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)并參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修飾[11]。在非惡性細(xì)胞中，HMGB1主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。在腫瘤細(xì)胞中，HMGB1表達(dá)增多，且可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間中[14]。HMGB1參與炎癥因子的表達(dá)和釋放，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而HIF-1α可能是HMGB1表達(dá)及細(xì)胞亞定位的重要調(diào)節(jié)因子[15]。QIU等[16]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)ERK/JNK信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。CHENG等[17]還發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)HMGB1轉(zhuǎn)為的釋放，進(jìn)而通過(guò)TLRs促進(jìn)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。而PTC中缺氧與HMGB1的相互表達(dá)及作用方式還未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，筆者通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α、HMGB1在PTC及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩者在PTC中表達(dá)升高，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1和HIF1a在PTC組織中的表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。提示兩者可能參與PTC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。通過(guò)相關(guān)性分析顯示，PTC組織標(biāo)本中HMGB1與HIF1a的表達(dá)呈正相關(guān)，提示HIF1a可能調(diào)控PTC細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)，進(jìn)而參與PTC的惡性過(guò)程。

盡管筆者在PTC臨床樣本中研究了HIF-1α與HMGB1的表達(dá)及其相關(guān)性，但還需要更多的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)深入研究?jī)烧叩恼{(diào)節(jié)機(jī)制及可能的信號(hào)通路。同時(shí)進(jìn)一步研究?jī)烧呷绾螀⑴cPTC的發(fā)生、發(fā)展，如腫瘤的增殖、血管生成、遷移及轉(zhuǎn)移等，以期為以HMGB1為PTC診斷及治療的分子靶點(diǎn)提供更進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。