骨化相關(guān)基因在椎間盤退行性變中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

施強(qiáng)慧，董敏杰，徐 辰，羅盛昌，吳曉東，劉 洋，陳華江，袁 文*

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員十二隊(duì)，上海 200433

2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

椎間盤退行性變（IDD）是脊柱外科常見病和多發(fā)病，會(huì)引起一系列臨床癥狀，是下腰痛及頸肩痛的主要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。IDD是一個(gè)多因素過程，包括基因因素、代謝和生物力學(xué)損傷等。發(fā)生退行性變的椎間盤會(huì)通過應(yīng)力失衡、血供障礙、免疫反應(yīng)、炎性因子介導(dǎo)等相關(guān)因素進(jìn)一步導(dǎo)致相應(yīng)癥狀及疾病的發(fā)生，而這些過程都與炎性因子密切相關(guān)［1］。炎性因子引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，并趨化巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞沿濃度梯度聚集于椎間盤，釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)一步加劇IDD［2］。然而炎癥作為已知的影響椎間盤的重要因素之一，其具體下游機(jī)制尚未完全闡明。近年研究表明，Runx2、BMP2、AGE-RAGE、IBSP等骨化相關(guān)基因在IDD中起重要作用［3-5］，認(rèn)為骨化相關(guān)基因及通路可能參與炎癥調(diào)控IDD的機(jī)制中。本文就近年關(guān)于BMP2、Runx2、糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-RAGE、IBSP等骨化相關(guān)基因在IDD中的作用及機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為IDD相關(guān)疾病機(jī)制研究提供思路。

1 IDD的分子機(jī)制

IDD是個(gè)多因素過程，而炎性因子在IDD過程中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等均能促進(jìn)IDD發(fā)生［6-8］，尤其IL-1β與TNF-α作為IDD模型建立的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)因子已被廣泛接受。細(xì)胞凋亡途徑也是學(xué)者關(guān)注的方向，有報(bào)道顯示，凋亡相關(guān)因子配體（FasL）在椎間盤髓核中可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞入侵，從而造成細(xì)胞凋亡。FasL的表達(dá)在B細(xì)胞和T細(xì)胞平衡的維持中發(fā)揮了重要作用［9］。

基質(zhì)降解因子在IDD中也起重要作用。炎性因子可通過下游激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）或金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）等基質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)影響IDD［10］。在體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和IL-1β參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，TGF-β1可降低ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá)，增加TIMP-3的表達(dá)；IL-1β處理后可顯著增加ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá)，而對(duì)TIMP-3的表達(dá)無明顯影響［11］。TNF-α表達(dá)增多，繼而活化NF-κB，也導(dǎo)致ADAMTS-4、ADAMTS-5表達(dá)增加［12］。

而在基質(zhì)合成方面，具有調(diào)節(jié)多項(xiàng)細(xì)胞生理功能的TGF-β超家族起到了主導(dǎo)地位［13］。TGF-β1能夠促進(jìn)人發(fā)生退行性變的髓核細(xì)胞合成Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱ），TGF-β3能夠增加鼠髓核細(xì)胞中ERK蛋白磷酸化，激活ERK信號(hào)通路，從而引起鼠髓核細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)增強(qiáng)，蛋白多糖含量增加［6-8］。在目前的報(bào)道中，有研究證明，在IDD進(jìn)程中，髓核細(xì)胞TGF-β可通過激活MAPK信號(hào)，導(dǎo)致硫酸軟骨素合成酶（CHSY1）在蛋白質(zhì)和RNA水平上的上升調(diào)節(jié)［14］；TGF-β還可通過Smad3，Rhoa/rock和MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)軟骨素聚合因子（ChPF）的表達(dá)，ChPF的表達(dá)與IDD的等級(jí)呈負(fù)相關(guān)，因而可用TGF-β來治療髓核細(xì)胞［14］；在IDD進(jìn)程中血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)顯著減少，IL-1β處理后的髓核細(xì)胞中COL-Ⅱ的表達(dá)降低，使用HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉（CoPP），可部分消除IL-1β的影響，防止COL-Ⅱ丟失［14］。因此，操縱HO-1表達(dá)可能會(huì)減輕髓核中細(xì)胞外基質(zhì)的代謝損傷，為IDD提供一種新的治療方法。

目前國內(nèi)外對(duì)于IDD的研究大多集中于炎性介質(zhì)學(xué)說機(jī)制，缺乏疾病特異性，這是目前的研究瓶頸。然而，同為TGF-β超家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）通路被認(rèn)為在IDD過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與BMP同為成骨分化關(guān)鍵因子的Runx2，其過表達(dá)會(huì)引起小鼠異位骨化和IDD［15-16］。因此，除了炎性因子作為IDD主要啟動(dòng)因素外，骨化相關(guān)基因可能也在IDD中扮演重要角色，但其具體機(jī)制目前仍缺乏系統(tǒng)研究，可成為新的研究方向。

2 成骨相關(guān)基因在IDD中的作用及潛在機(jī)制

2.1 BMP2

BMP2作為BMPs及TGF-β超家族中的一員，可刺激椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成。BMP2是參與成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等生長、分化、凋亡的多功能生長因子，其受體在IDD中表達(dá)已被闡明［17-18］。BMP2在人髓核和纖維環(huán)細(xì)胞中表達(dá)并具有抗分解代謝的作用，其主要機(jī)制是影響介導(dǎo)IL-18分解的代謝通路。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP2可能起到拮抗IL-18的作用，而IL-18是一種降解椎間盤基質(zhì)的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，因此，BMP2可能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)IDD［19］。此外，在小鼠模型中細(xì)絲蛋白B（FLNB）的缺失會(huì)導(dǎo)致纖維環(huán)細(xì)胞TGF-β經(jīng)典和BMP非經(jīng)典通路的激活，從而導(dǎo)致纖維環(huán)軟骨化及髓核破裂，引起椎間盤退行性變、破裂及相鄰椎體融合［20］。與正常纖維環(huán)細(xì)胞相比，來自發(fā)生退行性變椎間盤的纖維環(huán)細(xì)胞具有更大的成骨分化趨勢(shì)，其BMP-SMAD通路活性亦更高，并受到退行性變相關(guān)的miR-221調(diào)控，而miR-221的過表達(dá)則可有效抑制發(fā)生退行性變的纖維環(huán)細(xì)胞的成骨分化［21］。而BMP7表達(dá)能下調(diào)IDD，被證明能夠通過刺激髓核蛋白多糖和膠原合成，恢復(fù)椎間盤高度，促進(jìn)IDD的恢復(fù)［13，22］。因此，BMP家族蛋白在IDD中的具體作用存在兩面性，即部分BMP家族成員可能促進(jìn)IDD發(fā)生，而其余BMP家族成員則能抑制IDD進(jìn)行，因此還有待進(jìn)一步在人體研究明確其實(shí)際作用。

2.2 Runx2

Runx2是成骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。在軟骨細(xì)胞分化過程中，每一種Runx蛋白不僅有獨(dú)特的作用，還有重疊的作用［23］。研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎早期的小鼠關(guān)節(jié)軟骨中有Runx2的高表達(dá)，并能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞成熟，這種誘導(dǎo)發(fā)生在MMP等降解基因表達(dá)之前，說明Runx2在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中起著重要作用［2］。而在IDD患者中，Runx2表達(dá)明顯上調(diào)，證實(shí)了Runx2在人體內(nèi)IDD過程中可能具有重要的病理生理意義［24］。有研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤軟骨終板退行性變加重與Runx2的表達(dá)量逐步增高密切相關(guān)［25］，從而提出Runx2作為預(yù)測(cè)腰椎椎間盤軟骨終板退行性變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Runx2轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)還可能與Wnt/β-catenin結(jié)合，在鈣化的椎間盤中起到增強(qiáng)鈣化的作用［26］。在發(fā)生退行性變的椎間盤中，COL-Ⅹ、堿性磷酸酶（ALP）和鈣化相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)類似于晚期骨關(guān)節(jié)炎的病理改變，表明在IDD過程中椎間盤細(xì)胞發(fā)生了類似成骨性的分化［27］。綜上，Runx2作為一種成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)活性與骨代謝、骨關(guān)節(jié)炎和IDD過程密切相關(guān)，然而目前對(duì)其在IDD中具體的分子機(jī)制研究仍未完全明確，值得進(jìn)一步研究探討。

2.3 AGE-RAGE

AGE是由非酶反應(yīng)或在糖堆積過程中游離氨基對(duì)蛋白質(zhì)、脂類和核酸反應(yīng)而形成的，其在正常衰老過程中往往較易生成，被證實(shí)參與多種病理性骨化過程，是誘發(fā)骨化的重要因素之一［28］。常見的AGE與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)聯(lián)，而其活性前體，如細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物甲基乙二醛（MG）及其衍生物都與細(xì)胞損傷相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，高AGE含量的飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠脊柱外源性AGE的積累，并與椎間盤異位鈣化和退行性變直接相關(guān)。AGE積累可誘發(fā)椎間盤局部的異位鈣化和結(jié)構(gòu)破壞，除了組織僵硬和脆性增加之外，還有多種可能途徑導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)破壞和疼痛癥狀出現(xiàn)［14］。此外，AGE的積累與椎間盤內(nèi)軟骨內(nèi)骨化有關(guān)，可能通過AGE-RAGE來誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞的肥大和成骨分化，而RAGE參與了這個(gè)成骨分化過程，因?yàn)槠湟种屏薈OL-Ⅺ和骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)［29］。因此，AGE-RAGE可能是IDD潛在的治療靶點(diǎn)，使AGE有可能成為防止IDD進(jìn)展的一種非侵入性治療選擇［14，30］。總而言之，AGERAGE的積聚會(huì)干擾椎間盤間質(zhì)的代謝，促進(jìn)鈣化、骨化以及IDD的發(fā)生，為未來治療IDD提供了潛在的可能靶點(diǎn)。

2.4 IBSP

IBSP作為成骨相關(guān)關(guān)鍵因子，在髓核、纖維環(huán)和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，在不同類型細(xì)胞中基因表達(dá)水平有差異。有研究通過高通量分析手段描述了牛和人的髓核和椎間盤的轉(zhuǎn)錄組差異，并在關(guān)節(jié)軟骨、纖維環(huán)和髓核細(xì)胞之間將差異進(jìn)一步區(qū)分，而在這些差異基因中就有IBSP［31］。IBSP也被認(rèn)為是一種潛在的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)記基因，在鼠的微陣列研究中，它在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平高于髓核細(xì)胞，該研究還發(fā)現(xiàn)與髓核或纖維環(huán)細(xì)胞相比，在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中IBSP及FBLN1基因表達(dá)更高，可作為髓核陰性或椎間盤細(xì)胞的標(biāo)記物來使用［32］。然而IBSP在IDD中的實(shí)際作用尚未被揭示，可作為未來研究的一個(gè)突破口。

2.5 其他骨化相關(guān)因子

上述因子在成骨分化以及骨質(zhì)形成中占有重要地位，但其他一些成骨相關(guān)因子近年來也逐漸被發(fā)現(xiàn)與IDD存在重要相關(guān)性。有研究表明，終板軟骨細(xì)胞中OPN基因以及外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）表達(dá)的顯著降低與終板軟骨鈣化密切相關(guān)，ALP的增高與終板軟骨鈣化以及IDD密切相關(guān)［33］。在另一項(xiàng)研究中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)椎間盤髓核中OPN的表達(dá)僅在退行性變時(shí)才呈現(xiàn)出陽性，這與終板軟骨中的表達(dá)趨勢(shì)恰恰相反［34］，體現(xiàn)出椎間盤中不同組份在IDD過程中骨化基因表達(dá)趨勢(shì)的差異。

除此之外，構(gòu)成骨化重要微環(huán)境的膠原基質(zhì)成分的變異也會(huì)影響IDD。COL-Ⅰ、COL-Ⅸ及COL-Ⅺ具有促進(jìn)骨化的作用，是成骨分化的重要微環(huán)境基質(zhì)成分。有研究發(fā)現(xiàn)，在IDD中這些基質(zhì)成分的異常沉積與退行性變密切相關(guān)。在芬蘭，COL9A2和COL9A3被證明與當(dāng)?shù)厝诉z傳性腰椎椎間盤疾病密切相關(guān)［35］。此外，在日本人群中發(fā)現(xiàn)COL11A2的SNP多態(tài)性與后縱韌帶骨化導(dǎo)致的狹窄密切相關(guān)，且該分析還鑒定了COL9A2中的雜合性堿基a/c突變會(huì)導(dǎo)致過早的翻譯終止，形成一種截短的A2（Ⅸ）鏈的合成，這種突變很可能導(dǎo)致組織中膠原蛋白含量減少，是IDD的重要遺傳性因素［35］。

綜上所述，成骨相關(guān)基因與IDD密切相關(guān)，或直接參與調(diào)控IDD的發(fā)生（如RUNX2，BMP2等），或通過干擾椎間盤間質(zhì)的代謝間接促進(jìn)IDD的進(jìn)行（如AGE-RAGE等），均表明這些成骨相關(guān)基因在IDD中具有重要作用，其潛在機(jī)制或許可以成為治療的靶點(diǎn)所在。

3 結(jié)語與展望

IDD是個(gè)多因素過程，其中炎性因子在退行性變過程中發(fā)揮了重要作用，炎性因子引起IDD已成為共識(shí)，但是缺乏疾病的特異性，有效靶點(diǎn)少，這是導(dǎo)致目前治療手段單一、非手術(shù)生物治療進(jìn)展緩慢的瓶頸所在［36］。然而通過對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，雖然關(guān)節(jié)軟骨和椎間盤形態(tài)上看起來是非常不同的結(jié)構(gòu)，但在組織及細(xì)胞層面有很多相似之處。髓核基質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的組成亦類似，都由COL-Ⅱ及蛋白聚糖組成［37］；此外，關(guān)節(jié)和半月板軟骨和椎間盤本質(zhì)上都是無血管組織，營養(yǎng)物質(zhì)主要通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞［38-40］；有研究通過生物信息分析表明髓核和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞群可能來源于一個(gè)共同的譜系［27］。綜上所述，椎間盤作為一類軟骨樣組織，其退行性變很可能與關(guān)節(jié)軟骨一樣，與成骨相關(guān)基因的激活有關(guān)。Runx2和BMP2的相關(guān)研究取得了一定成果并受到關(guān)注，但對(duì)于其他骨化相關(guān)因子（如IBSP），相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少，但這些少量的研究也表明其與IDD之間存在一定的相關(guān)性。因此，筆者推測(cè)這些骨化相關(guān)基因可能與IDD的發(fā)生機(jī)制相關(guān)，是導(dǎo)致椎間盤髓核及相關(guān)細(xì)胞退行性變的特異性內(nèi)在因素，但具體作用有待進(jìn)一步體外及體內(nèi)的相關(guān)研究證明，值得后續(xù)進(jìn)一步深入研究。