新型微支架裝載脂肪間充質干細胞移植修復椎間盤退行性變

陳 春，何 凡，金廣建，陳 雷

溫州醫科大學附屬第一醫院骨科，溫州 325000

下腰痛與椎間盤退行性變密切相關［1］。當前，早中期的非手術治療和晚期的侵襲性手術是臨床治療椎間盤退行性變的經典手段，但目前沒有一種有效方法能夠完全修復發生退行性變的椎間盤［2］。近年來，生物材料裝載干細胞移植技術修復發生退行性變的椎間盤成為國內外研究的熱點。研究證實，具有形狀記憶性質的彈性多孔明膠微支架在注射時具有完全恢復形變的特點，并且發現其具有良好的生物力學強度［3-4］。明膠微支架可以體外修飾間充質干細胞（MSC），在注射治療時可以使細胞內蛋白多糖等基質成分明顯增加，延長細胞在注射部位的存活時間［3，5］。本研究將明膠微支架裝載脂肪間充質干細胞（ADMSC）移植入椎間盤退行性變動物模型中，觀察椎間盤修復效果，為其進一步的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

健康成年比格犬12只，年齡11 ～ 14個月，平均體質量12 kg，由溫州醫科大學動物實驗中心提供（檢疫合格證號20160151）。實驗獲得溫州醫科大學倫理委員會批準（WZMD-205）。DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司，慢病毒包裝質粒購自上海生智科技公司，ELISA試劑盒購自上海柏慧康生物科技有限公司。

1.2 ADMSC提取和標記

提取犬自體ADMSC，取第3代細胞用于后續實驗。將細胞培養液吸除，換新鮮培養液，同時加入表達綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒（Luc-GFP）1 mL。將培養瓶置于37℃、5%CO2培養箱培養1 h后，吸去培養液，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液繼續培養3 d，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達。

1.3 明膠微支架制備及與ADMSC復合培養

使用計算機輔助技術軟件制作微孔陣列圖形，以聚甲基丙烯酸酯薄板為原料制作微孔模具板，等離子處理2 min。將明膠粉末配制成質量體積比為6%的溶液，在冰上（保證低溫環境，防止室溫成膠）加入0.3%戊二醛溶液使其充分混合，即配成微支架預聚物溶液。然后將溶液真空冷凍干燥形成多孔聯通結構（-45℃，30 min）。形成的微支架浸泡于雙蒸水中即可從模具板上脫出，使用70 μm漏網收集，然后用蒸餾水清洗并濾除多余水分。將微支架置于小皿中鋪成薄層，二次冷凍。冷凍干燥后使用紫外線滅菌或環氧乙烷滅菌備用，每次收集600個微支架。將ADMSC和微支架在培養基中共培養，微支架可自動吸附ADMSC，檢測后發現每次可吸附1 000個ADMSC［4］。采用電鏡觀察微支架裝載干細胞的形態。

1.4 實驗動物分組及模型建立

術前對12只比格犬行腰椎X線片及MRI檢查，排除脊柱疾病及椎間盤退行性變。每只犬椎間盤分為5組：對照組（L7/S1）、模型組（L3/L4）、干細胞組（L4/L5）、微支架組（L5/L6）、微支架裝載干細胞組（L6/L7）。采用穿刺抽吸髓核組織法進行椎間盤造模［6］。動物麻醉后，經左側腹膜外入路暴露L4～7橫突，顯露L3/L4/L5/L6/L7椎間盤，用18G穿刺針穿刺至深度約8 mm，用10 mL注射器負壓抽吸，抽吸出少量膠凍狀髓核組織。干細胞組、微支架組、微支架裝載干細胞組分別用21G微量注射器加壓注射ADMSC、微支架及微支架和ADMSC共培養物，注射后保持2 min再拔針（圖1）。傷口分層縫合后用無菌棉墊覆蓋，常規飼養觀察。手術后4、8、12、24周進行影像學檢查，24周時處死所有犬，取髓核組織進行指標檢測。

1.5 腰椎影像學檢查

應用CD manager軟件，在側位X線片上測量椎間盤相對高度（術后椎間盤高度與術前椎間盤高度的比值）［7］。用3.0 T MRI對腰椎椎間盤行矢狀位掃描，測定相應椎間盤髓核及腦脊液的灰度值，以髓核灰度值與腦脊液灰度值的比值作為椎間盤相對灰度［7］。

1.6 椎間盤組織學檢測

取犬L3/L4/L5/L6/L7/S1椎間盤髓核組織，一部分進行冰凍熒光檢測，一部分用甲醛溶液固定72 h后進行HE和番紅O染色，另一部分用ELISA試劑盒檢測軟骨相關蛋白SOX-9、PG和COL2蛋白的含量。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 微支架裝載干細胞的形態和ADMSC標記結果

通過21G針頭時，明膠微支架形態保持不變，均一懸浮在質量體積分數為0.5%的透明質酸水溶懸浮液中（圖1a）。電鏡下可觀察到圓柱狀的微支架具有內部相互連通的大孔結構（圖1b ～ d），類圓形ADMSC包裹于其中（圖1e）。采用Luc-GFP慢病毒感染后，ADMSC生長狀態良好，形態正常（圖1f）；感染后第3天，在熒光顯微鏡下可觀察到Luc-GFP+-ADMSCs表達（圖1g）。

圖1 微支架裝載干細胞的形態和ADMSC標記結果Fig. 1 Morphology of ADMSCs loaded with micro-scaffolds and ADMSC labeling results

2.2 移植后ADMSC存活情況及各組影像學結果

24周時干細胞組和微支架裝載干細胞組均可觀察到少許Luc-GFP+-ADMSCs，微支架裝載干細胞組可見更多的Luc-GFP+-ADMSCs（圖2a，b）。影像學檢查結果（圖2c，d；表1，2）顯示，造模后4、8、12、24周，各組椎間盤相對高度和相對灰度持續降低，與對照組相比差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；在8、12、24周時，微支架裝載干細胞組椎間盤相對高度和相對灰度高于模型組、干細胞組和微支架組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。

2.3 各組髓核組織學改變

24周時，HE染色示模型組退行性變嚴重，微支架裝載干細胞組、微支架組及干細胞組髓核發生中度退行性變，其中微支架裝載干細胞組椎間盤退行性變程度較模型組、干細胞組和微支架組輕；番紅O染色示微支架裝載干細胞組、微支架組及干細胞組基質均較模型組增多，其中微支架裝載干細胞組基質較干細胞組增多；大體標本示模型組和微支架組髓核發生嚴重退行性變（圖3）。

圖 2 移植后ADMSC存活情況及各組影像學結果Fig. 2 ADMSCs survival after injection and imaging results of each group

表1 不同時間點各組椎間盤相對高度Tab. 1 Disc relative height of each groups at different time points n=12，±s

表1 不同時間點各組椎間盤相對高度Tab. 1 Disc relative height of each groups at different time points n=12，±s

注：*與對照組比較，P ＜ 0.05；△與模型組比較，P ＜ 0.05；▲與微支架裝載干細胞組比較，P ＜ 0.05Note ：* P ＜ 0.05，compared with control group ；△P ＜ 0.05，compared with model group ；▲P ＜ 0.05，compared with micro-scaffold+ADMSC group

對照Control 0.982±0.018 0.981±0.021 0.978±0.020 0.983±0.017 0.984±0.018 微支架裝載干細胞Micro-scaffold+ADMSC 0.977±0.020 0.795±0.054* 0.744±0.046*△ 0.621±0.068*△ 0.591±0.053*△

表2 不同時間點各組椎間盤相對灰度Tab. 2 Disc relative gray of each groups at different time points n=12，±s

表2 不同時間點各組椎間盤相對灰度Tab. 2 Disc relative gray of each groups at different time points n=12，±s

注：*與對照組比較，P ＜ 0.05；△與模型組比較，P ＜ 0.05；▲與微支架裝載干細胞組比較，P ＜ 0.05Note ：* P ＜ 0.05，compared with control group ；△P ＜ 0.05，compared with model group ；▲P ＜ 0.05，compared with micro-scaffold+ADMSC group

組別Group 0周0 week 4周4 weeks 8周8 weeks 12周12 weeks 24周24 weeks對照Control 0.690±0.023 0.707±0.028 0.712±0.018 0.700±0.031 0.705±0.025模型Model 0.690±0.031 0.625±0.055* 0.426±0.062* 0.349±0.035* 0.321±0.064*干細胞ADMSC 0.705±0.027 0.636±0.075* 0.533±0.084*△▲ 0.481±0.059*△▲ 0.416±0.059*△▲微支架Micro-scaffold 0.700±0.022 0.611±0.079* 0.538±0.066*△▲ 0.458±0.072*△▲ 0.390±0.057*△▲微支架裝載干細胞Micro-scaffold+ADMSC 0.720±0.023 0.650±0.047* 0.614±0.053*△ 0.566±0.045*△ 0.530±0.059*△

圖 3 各組髓核組織學檢查結果Fig. 3 Histological results of nucleus pulposus in each group

2.4 各組髓核中軟骨相關蛋白的表達

ELISA檢測結果顯示，與對照組對比，其他各組髓核中軟骨相關蛋白SOX-9、PG和COL2含量均降低，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，表3）；其中模型組最低，與干細胞組、微支架組和微支架裝載干細胞組相比差異均有統計學意義（P ＜ 0.05，表3）；微支架裝載干細胞組高于模型組、干細胞組和微支架組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，表3）。

表3 24周時各組SOX9、PG和COL2的含量Tab. 3 Content of SOX9，PG and COL2 at 24 weeks in each group n=12，±s，pg·mg-1

表3 24周時各組SOX9、PG和COL2的含量Tab. 3 Content of SOX9，PG and COL2 at 24 weeks in each group n=12，±s，pg·mg-1

注：*與對照組比較，P ＜ 0.05；△與模型組比較，P ＜ 0.05；▲與微支架裝載干細胞組比較，P ＜ 0.05Note ：* P ＜ 0.05，compared with control group ；△P ＜ 0.05，compared with model group ；▲P ＜ 0.05，compared with micro-scaffold+ADMSC group

組別Group SOX9 PG COL2對照Control 412.30±19.99 163.85±25.57 165.53±17.81模型Model 51.08±12.77* 24.68±6.46* 32.26±7.26*干細胞ADMSC 165.24±33.35*△▲ 84.29±14.03*△▲ 84.29±14.03*△▲微支架Micro-scaffold 149.40±18.42*△▲ 74.55±17.51*△▲ 66.23±21.68*△▲微支架裝載干細胞Micro-scaffold+ADMSC 210.45±28.36*△ 109.81±7.41*△ 109.81±7.47*△

3 討 論

微支架作為一種新型的細胞載體材料備受關注。研究證實，微支架具有良好的生物相容性、低免疫原性、較強的機械性能及良好的多孔連通性與氣液傳遞性，并且具有類似海綿的形狀記憶特性，即使在極度壓縮變形后仍可恢復原形，使得其通過微創注射的方式進行細胞治療成為可能［8］。毛曉晶等［9］將明膠微支架與干細胞復合培養后發現，干細胞可保持較高活性，成脂成骨分化相關基因表達水平較二維誘導環境高。本研究采用前期報道的一種新型明膠微支架［8，10］，通過微加工的工程方法制備微孔模具，低溫成膠。這種微支架可以達到微米級別，是機械性能良好的細胞運載工具，而且通過適當加壓可以促進細胞的軟骨分化，在細胞治療領域有其獨特優勢和潛在應用價值［10］。

干細胞再生醫學的發展為椎間盤退行性變的治療帶來了新的希望［11］。但是由于髓核組織內壓力過大，注射的干細胞懸液容易通過注射針孔反流而產生不良反應，如形成骨贅等引起額外的疼痛［12］；而且發生退行性變的髓核組織內環境惡劣，注入的干細胞可能大部分無法耐受而凋亡。本研究采用的微支架材料具有干細胞保護功能，并且采用21G注射器抽吸髓核組織，與既往研究采用的18G注射器［6］相比，更能減少纖維環的損傷。有學者采用膠原蛋白的纖維環塞解決細胞滲漏問題，但實際上并未達到預期效果［13］。本研究觀察到在第24周時干細胞組運動節段周圍的組織纖維包塊比較明顯，與以往的研究結果類似。但該現象在微支架裝載干細胞組并沒有發現，分析原因可能是發生退行性變的纖維環也可以進行部分修復，通過微小注射器最大程度減少對纖維環的破壞；并且，預成膠的明膠微支架占據了內部空間，當針頭從組織中拔出時立刻堵住針孔，有效防止了滲漏。當然，也可能與本研究采用的細胞量較少有關；注射的明膠微支架和針頭的尺寸也與此有關。

本研究采用犬椎間盤退行性變模型，經影像學、組織學及分子生物學結果證實，采用微支架裝載干細胞能夠更好地延緩椎間盤的退行性變。分析其原因：①微支架保護干細胞免受注射過程和退行性變環境的損傷；②微支架促進干細胞存留；③微支架內的微環境調節干細胞成軟骨分化；④微支架的機械性能有助于干細胞承受高內壓。然而，結果發現椎間盤的恢復程度仍然有限，可能因為采用的模型椎間盤退行性變嚴重；而且，為了注射更多的微支架和干細胞，本研究吸出了比其他研究更多的髓核組織［（25.0±5.1）mg vs.（16.6±3.5）mg［6］］。單純微支架組也表現出一定的治療效果，可能是因為微支架能為發生退行性變的椎間盤提供機械支撐從而降低退變速度。

微支架可隨時間逐漸降解［10］。本研究發現微支架組在治療后24周時髓核組織中無微支架網狀結構（圖3），說明微支架可能在高壓環境下發生了降解。微支架輔助性策略在細胞滲漏與承載壓力方面起到重要作用，但仍需提高該材料長期維持功能的效果。

既往研究發現MSC在移植入髓核后發生分化［14］，也有研究認為MSC不能在發生退行性變的環境中存活［15］。本研究未觀察到ADMSC的長期增殖，也許與低劑量注射和退行性變程度較重有關，Luc-GFP表達降低可能也是另一個原因。本研究發現干細胞的確能夠改善椎間盤退行性變，但由于24周時只有少量的細胞，沒有觀察到干細胞的具體轉歸。今后將進一步探索細胞轉歸以明確ADMSC的作用機制。

綜上所述，本研究通過24周的觀察，發現明膠微支架裝載ADMSC移植可延緩比格犬椎間盤退行性變，有望為發生退行性變的椎間盤組織的修復治療提供新的策略。今后仍有必要進行更長期的觀察，以進一步明確微支架裝載干細胞對椎間盤退行性變的療效，而且，對于明膠材料的改進及細胞的轉歸仍有待于進一步探索。