黃連素在脊髓損傷中對線粒體的保護作用及機制

王 奕，于榮華，徐 煒，朱曉東，林浩東*

1.海軍軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海 200003

2.上海市交通大學醫學院附屬同仁醫院骨科，上海 200050

脊髓損傷（SCI）是骨科、神經科的嚴重疾病之一，常導致完全或不完全性的感覺、運動以及自主神經功能障礙等［1-2］，嚴重威脅患者的健康和生命［2-3］。SCI具有十分復雜的病理生理過程，主要分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷指外力導致的直接性破壞，通常是不可逆的［4］。而繼發性損傷是導致SCI后病理級聯反應的主要組成部分，是可逆的，因此，目前的研究多集中在繼發性損傷方面。繼發性損傷包括炎性反應、Ca2+超載、氧化應激、興奮性氨基酸釋放、線粒體應激等一系列病理過程，最終導致神經元、膠質細胞凋亡，引發運動和感覺障礙［5］。線粒體在中樞神經系統的多種疾病中扮演著非常重要的角色，通過干預線粒體氧化損傷以抑制SCI后細胞凋亡、促進神經功能恢復已經成為研究前沿與熱點。

黃連素（小檗堿）是從中國傳統中藥黃連中提取的一種天然的異喹啉類生物堿，具有抗炎、抗菌、抗癌及降糖等多種藥理作用［6-7］。近年來，黃連素在神經系統疾病中的作用日益被重視。研究發現，黃連素可保護運動神經元［8］，對神經退行性病變具有潛在治療作用［9］，并且可減輕腦缺血再灌注損傷［10］。與此同時，有研究證實黃連素具有抗氧化應激、保護線粒體的作用，Zhang等［11］通過體外實驗證明黃連素可以保護干細胞，降低低氧誘導的細胞凋亡率；Gomes等［12］發現黃連素可以介導SIRT1依賴的線粒體途徑減輕胰島素抵抗。本研究旨在通過測定黃連素對SCI后線粒體氧化和神經細胞凋亡的影響，研究黃連素對SCI的可能作用與機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

黃連素購自Sigma-Aldrich公司；PSI-IH脊髓打擊器購自新澤西州立大學；丙二醛（MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（強）、線粒體和胞質蛋白制備試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞色素C（Cyt C）單克隆抗體（ab110325，1∶1 000稀釋）、羊抗兔IgG-HRP抗體（ab6721，1∶2 000稀釋）、羊抗鼠IgG-HRP抗體（ab6789，1∶2 000稀釋）、NeuN單克隆抗體（ab177487，1∶1 000稀釋）、FITC標記的羊抗兔IgG（ab6717，1∶500稀釋）購自Abcam公司；caspase-3單克隆抗體（9661s，1∶1 000稀釋）、cleaved capase-3單克隆抗體（8172S，1∶1000稀釋）、β-actin單克隆抗體（4970S，1∶1 000稀釋）購自CST公司；TUNEL染色試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red；12156792910）購自Roche公司。全自動酶標儀和電泳儀購自Bio-Rad公司；-80℃超低溫冰箱購自Thermo公司；高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；冰凍切片機購自Leica公司；熒光顯微鏡購自Olympus集團。

1.2 SCI模型制備與動物分組

SPF級健康雄性C57小鼠36只（上海交通大學醫學院附屬同仁醫院實驗動物中心），體質量250 ～300 g，采用隨機數字表法平均分為3組（n=12），即假手術組、SCI組、黃連素組。假手術組僅去除椎板和棘突顯露脊髓，不進行造模打擊；SCI組、黃連素組使用PSI-IH脊髓打擊器制備SCI模型［13］，打擊點T10，損傷力為0.6 N，停留時間為0 s。模型成功標準：脊髓充血，雙下肢痙攣抽動，尾巴痙攣擺動，BBB評分為0分。模型制備成功后立即經腹腔注射給藥一次，劑量為10 mg/kg（根據前期預實驗結果及參考文獻［14］方法確定，SCI組注射生理鹽水，黃連素組注射黃連素）。術后小鼠自由進食和飲水，飼養環境室溫維持在23℃ ～ 25℃，保持干燥通風。協助SCI小鼠排尿、排便，每日3次。

1.3 小鼠脊髓組織線粒體GSH、MDA、SOD的檢測

各組小鼠于SCI后24 h麻醉，迅速取出以打擊點為中心、頭尾端各0.5 cm（共計1.0 cm）的脊髓組織，進行生物化學檢測和蛋白質印跡分析。取脊髓組織，剪碎、勻漿，根據線粒體和胞質蛋白制備試劑盒說明進行操作，分離線粒體和胞質蛋白。取提純的線粒體，按照GSH、MDA、SOD試劑盒說明書進行操作，使用全自動酶標儀進行檢測，最后根據BCA法測得的線粒體蛋白濃度進行換算，得出各組線粒體中GSH、MDA、SOD的水平。

1.4 小鼠脊髓組織caspase-3、cleaved caspase-3以及細胞質內和線粒體內Cyt C的檢測

取相應的脊髓組織、胞質蛋白或提純的線粒體，制備蛋白樣品，進行凝膠電泳。電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜上，將轉印后的PVDF膜置于封閉液中室溫下搖床封閉1 h。根據檢測蛋白所在區域裁剪PVDF膜，分別置于caspase-3一抗（1∶1 000稀釋）、cleaved caspase-3一抗（1∶1 000稀釋）、Cyt C一抗（1∶1 000稀釋）和β-actin一抗（1∶1 000稀釋）中，4℃搖床孵育過夜。用TBST室溫洗膜3次，將膜置于山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000稀釋）中，室溫搖床孵育1 h。取出后再用TBST洗膜3次。將超敏ECL試劑盒中A液和B液等體積混合后滴加于PVDF膜上，利用凝膠成像系統曝光成像，保存蛋白圖像，利用Image J軟件對蛋白圖像進行分析。

1.5 脊髓組織中神經細胞凋亡的檢測

SCI后24 h麻醉小鼠，仰臥位胸部備皮，打開胸腔暴露心臟，迅速將細針刺入小鼠主動脈，用止血鉗固定，連接恒流泵進行灌注。灌注50 mL生理鹽水后，再低速灌注4%多聚甲醛溶液20 min。灌注完成后立即取出以打擊點為中心、頭尾端各0.5 cm（共計1.0 cm）的脊髓組織，用4%多聚甲醛浸泡固定24 h，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水各24 h。脫水完畢后，在-20℃環境中用OCT包埋劑包埋脊髓組織。使用冰凍切片機在-20℃條件下連續切取脊髓冠狀面組織切片，切片厚度為5 μm。從打擊中心開始，頭尾端每隔3張切片取1張，每個組織共取6張切片，將組織切片貼附于載玻片上，放入冰箱中以備免疫熒光染色檢測。

取出制備好的切片，復溫后用PBS浸洗3次，加正常驢血清封閉1 h。將一抗NeuN（1∶1 000稀釋）滴加到切片上，4℃避光孵育過夜，用PBS浸洗3次。加入FITC標記的羊抗兔IgG（1∶500稀釋），室溫避光孵育1 h，用PBS浸洗3次。按照TUNEL染色試劑盒說明書進行操作。最后每張組織切片滴加30 μL的DAPI溶液（2 μg/mL），避光、室溫孵育3 min。在200倍視野下，每張切片隨機選取6個視野，觀察計數綠色熒光的NeuN標記與紅色的凋亡小體標記共同定位的TUNEL陽性細胞數。

1.6 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析。實驗數據均采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠SCI模型的可重復性和標準性

采用PSI-IH脊髓打擊器制備小鼠SCI模型，全程計算機控制，打擊脊髓后小鼠雙后肢迅速出現痙攣性抽搐，尾巴翹起并左右搖擺，隨后出現雙后肢肌力喪失，銳器刺激雙下肢無反應，喪失自主排尿能力。通過IH Spinal Cord Impactor Software V5.0.4軟件瞬間獲得脊髓受打擊時的所有信息，如位移/打擊力曲線、設定力大小、實際撞擊力大小、脊髓位移等，各實驗動物SCI模型曲線一致。同時分析各實驗動物實際打擊力量，符合正態分布［打擊力為（0.581 67±0.049 97）N］，說明SCI模型具有良好的穩定性和適用性。

2.2 各組小鼠脊髓組織線粒體中MDA、GSH、SOD水平

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織MDA水平增高，GSH、SOD水平降低；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織MDA水平降低，GSH、SOD水平增高；差異均有統計學意義（P ＜ 0.05，圖1）。

2.3 各組小鼠脊髓組織線粒體和細胞質內Cyt C表達水平

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織線粒體中Cyt C表達量減少，細胞質內Cyt C表達量增多；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織線粒體中Cyt C表達量增多，細胞質內Cyt C表達量減少；差異均有統計學意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖1 各組小鼠脊髓組織線粒體內MDA、GSH和SOD水平Fig. 1 Levels of MDA，GSH and SOD in mitochondria of each group

圖2 各組小鼠脊髓組織中線粒體和細胞質內Cyt C水平Fig. 2 Levels of Cyt C in mitochondria and cytoplasm of each group

2.4 各組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平

SCI組小鼠脊髓組織中凋亡關鍵分子caspase-3的表達量較假手術組增多（P ＜ 0.05）；黃連素組caspase-3表達量與SCI組相比降低（P ＜ 0.05），與假手術組相比增高（P ＜ 0.05）。各組cleaved caspase-3表達趨勢與caspase-3一致。見圖3。

與假手術組相比，SCI組、黃連素組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平增高；與SCI組相比，黃連素組小鼠脊髓組織中caspase-3、cleaved caspase-3表達水平降低；差異均有統計學意義（P ＜ 0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠脊髓組織中caspase-3和cleaved caspase-3表達量Fig. 3 Expressions of caspase-3 and cleaved caspase-3 in each group

2.5 神經元凋亡免疫熒光雙標記染色

圖4a中藍色熒光的DAPI標記細胞核，綠色熒光的NeuN標記神經細胞，紅色熒光的TUNEL法標記凋亡小體，綠色與紅色熒光共同定位的細胞為凋亡神經細胞。與假手術組相比，SCI組與黃連素組小鼠脊髓組織中神經細胞凋亡數量增多；與SCI組相比，黃連素組神經細胞凋亡數量減少；差異均有統計學意義（P ＜ 0.05，圖4b）。

3 討 論

圖4 各組小鼠脊髓組織中神經元凋亡情況Fig. 4 Neural apoptosis in each group

近年研究表明，SCI后脊髓神經元的死亡和缺失主要是由細胞凋亡導致，并非緣于原發性直接損傷，因此，如何有效抑制SCI后細胞凋亡是預防或減輕繼發損傷、促進相關功能恢復的關鍵。細胞凋亡是在生理或病理情況下，細胞主動激活并按照特定方式進行的一種由遺傳信息調控的細胞死亡途徑，與繼發性SCI的重要環節——氧化應激密切相關。SCI后體內氧化與抗氧化作用失衡，內環境更傾向于氧化狀態，產生大量氧化中間產物，超過機體的清除能力，導致組織中的氧自由基大量堆積，使包括線粒體膜在內的各種生物膜性結構完整性及通透性遭到破壞，多種細胞器功能異常，產生更多的氧自由基，形成氧化應激惡性循環［15］，對能量代謝豐富的脊髓組織中線粒體損傷極為顯著。

線粒體損傷會導致脂質過氧化物積聚。本研究選取MDA、GSH、SOD作為檢測氧化損傷的指標。MDA是一種脂質過氧化的終產物，是常用的反映組織氧化損傷程度的指標；GSH作為一種脂質過氧化物清除劑，其含量是衡量機體抗氧化能力的重要標準；SOD是機體內清除氧自由基的重要保護性物質，是反映機體抗氧化能力的經典指標。本研究發現，SCI后脊髓組織線粒體中MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，說明SCI可以誘導氧化損傷和線粒體損傷，與本研究預實驗及其他研究相符［15-16］。而在SCI模型建立后24 h，應用黃連素能明顯抑制線粒體MDA的產生，同時促進SOD、GSH的產生，說明黃連素能夠抑制SCI后線粒體的氧化應激反應，對線粒體起到保護作用。此外，Hsu等［8］發現黃連素通過抗氧化損傷和PI3K/Akt通路發揮神經細胞保護作用。Yu等［17］證實黃連素可以通過保護線粒體減輕腎小管細胞的低氧再灌注損傷。Yan等［6］證實黃連素與線粒體存在密切關系。在腫瘤細胞中，中毒劑量的黃連素可以抑制線粒體的功能，從而抑制腫瘤細胞的增殖，說明線粒體可能是黃連素的藥理作用靶點之一。

線粒體氧化應激反應可以激活線粒體凋亡通路，從而導致神經元的缺失。Cyt C是生物氧化過程中的重要電子傳遞體，其對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。在神經系統中，Cyt C通常定位于神經細胞線粒體內，參與氧化呼吸鏈反應，為細胞供給能量。但在氧化應激、炎癥等損傷情況下，線粒體膜結構發生破壞，Cyt C從線粒體釋放到細胞質中，與一系列凋亡因子或蛋白相互作用，最終導致細胞凋亡關鍵執行者caspase-3激活為cleaved caspase-3，從而介導caspase家族依賴性細胞凋亡途徑。本研究發現，SCI后脊髓組織細胞線粒體內Cyt C降低，釋放進入細胞質。結合生物化學的檢測結果，印證了SCI可以介導線粒體氧化應激、促進Cyt C的釋放。注射黃連素后Cyt C從線粒體中的釋放減少，說明黃連素可以通過抗氧化損傷保護線粒體。本研究進一步檢測了各組小鼠脊髓組織內caspase-3及cleaved caspase-3的表達水平，發現SCI引起caspase-3、cleaved caspase-3表達升高，激活凋亡途徑，而黃連素可以抑制caspase凋亡途徑。因此，推測黃連素可能通過抗氧化損傷及抑制線粒體凋亡通路保護線粒體，在SCI中起到神經保護作用。

由于脊髓組織中存在神經細胞、膠質細胞等多種細胞，為了進一步明確黃連素對神經元的作用并排除其他細胞的影響，本研究采用免疫熒光雙標染色，分別選取了細胞核標記物DAPI、神經元特異性標記物NeuN和TUNEL法進行共染色，結果顯示，與SCI組相比，黃連素組神經細胞凋亡數量減少，說明黃連素可以保護SCI后脊髓神經元、抑制神經元凋亡。

綜上所述，黃連素可減輕SCI小鼠脊髓組織中神經細胞凋亡，這可能與其抑制線粒體氧化損傷、減少Cyt C釋放、降低凋亡蛋白表達有關。黃連素作為傳統中藥的主要成分，其作用與機制是多方面的。Yu等［17］發現黃連素對于腎小管缺氧損傷的保護作用一方面來源于保護線粒體，另一方面與抑制內質網應激也密切相關。Hsu等［8］指出黃連素的神經保護功能與激活Nrf2核轉移以及PI3K/Akt通路相關，此外，抗氧化損傷和抑制相關凋亡蛋白表達也是黃連素在神經系統中的可能機制之一。Lu等［18］發現黃連素可能通過激活AMPK通路、減少能量儲備而抑制神經軸突的生長。因此，雖然本研究從細胞器水平、線粒體方面解讀了黃連素對于SCI的作用，但其在神經等系統中的機制尚有待進一步研究。