TIM-3-574G>T基因多態性與中國漢族人群支氣管哮喘的相關性分析

梁卓政 郭 程 孟 平 李洪濤 張天托

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為基礎的異質性疾病，發作時其主要癥狀包括胸悶、咳嗽、喘息氣短等，并有可逆性氣流受限[1-2]。哮喘作為一種與過敏相關的疾病，CD4+T細胞在其發病過程中起著重要作用。在免疫應答過程中CD4+T細胞在不同類型抗原刺激下可繼續分化，根據所分泌的細胞因子不同可分為Th1和Th2兩個亞群。Th1/Th2細胞發揮正常功能及數量上保持平衡狀態是維持機體正常免疫的基礎；Th1/Th2細胞功能異常或失衡，是引起多種免疫相關疾病的重要因素。一般認為哮喘發病機制中存在向Th2細胞的免疫偏離。

直到現在，盡管哮喘的病因仍然不明，但是可以確定基因與其發病密切相關[3]。近幾年來，全基因組技術的應用證實了多種基因與哮喘發生的密切關系。Toll樣受體2和4(TLR2、TLR4)、血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)、整合素和金屬蛋白酶33(ADAM33)、CD14、IL-4R和IL-6R等的基因多態性與哮喘易感性之間的關系已得到大量的研究支持[4-9]。有文獻顯示TIM-3-574 G>T基因多態性與中國人群支氣管哮喘的發病風險有關，然而由于單個研究樣本量有限，各研究結果存在一定差異。因此，本文利用已發表的中國漢族人群支氣管哮喘與TIM-3-574G>T基因多態性的相關研究進行Meta分析，旨在通過對多個獨立研究進行定量合并，增大樣本量，增加結果的說服力，彌補單個研究樣本量不足的缺點。

資料與方法

一、數據庫和檢索詞

選擇Pubmed、Embase、Web of Science(WOS)、CNKI、萬方數據庫以及SinoMed進行檢索，末次檢索時間為2017年12月20日。使用如下關鍵詞檢索：哮喘(asthma)、多態(polymorphism* or variant*)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-3(T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-3 or TIM-3)，結合高級檢索(將字段限定在中文的“主題”與英文的“Title/Abstract”)和主題詞檢索策略對相關文獻進行篩選，同時采用文獻追蹤的方法繼續跟蹤之后可能出現的最新研究文獻。篩選流程如圖1所示。

二、文獻資料的納入標準和排除標準

1. 納入標準

(1)所有文獻均需提供診斷其患者為支氣管哮喘診斷標準：①反復發作的胸悶、咳嗽、喘息氣短；②發作時在雙肺可聞及散在或彌漫性、以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；③上述癥狀經平喘藥物治療后可緩解或自行緩解；④排除其他疾病引起的胸悶、咳嗽、喘息氣短；⑤臨床表現不典型者應至少具備以下一項試驗陽性：a.支氣管激發試驗或運動試驗陽性；b.支氣管舒張試驗陽性(1 s用力呼氣容積增加15%以上，且增加絕對值>200 ml)；c.最大呼氣流量日內變異率或晝夜波動率≥20%；符合以上1～4項或4～5項者，可以診斷為哮喘。

圖1 Meta分析納入文獻篩選流程圖

(2)文獻設計類型病例對照研究。

(3)文獻中有提供TIM-3-574 G>T(rs10515746)多態性的檢測信息，并提供統計軟件分析所需的數據。

(4)對照組人群的基因型頻率分布需滿足Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

(5)病例組與對照組之間具有可比性，即年齡、種族等比較差異無統計學意義。

2. 排除標準：①以家族系為背景的研究;②文獻提供的信息不全或無法進行統計分析的文獻；③同一篇文獻結果重復發表，取其樣本量最大，可提供信息最全的一篇作為納入文獻;④學位論文、會議文獻;⑤研究對象為非中國漢族人種；⑥參考The Newcastle-Ottawa quality assessment scale(NOS)的病例對照研究文獻質量評價標準[10]進行文獻質量評估，剔除評分比較低的文獻。

三、研究方法

由兩名研究人員使用上述統一的納入標準和排除標準進行文獻篩選，獨立提取數據，并制成數據提取表，而后相互交換核對，最后達到意見統一，數據一致。提取的內容包括：第一作者、發表年份、研究類型、國家、人群的種族、基因多態性檢測手段以及TIM-3-574 G>T(rs10515746)基因型頻率分布數據等。

四、統計學方法

采用RevMan 5.3軟件對提取的數據進行統計分析。由于納入的文獻中均沒有TIM-3 rs10515746 TT基因型數據，故使用顯性模型GT/GG以及位點比較模型G/T對提取的數據進行統計分析，以OR值和95%CI作為研究效應指標，并對研究結果的進行異質性檢驗。若檢驗統計量I2<50%，說明各納入文獻之間異質性比較小，可采用固定效應模型進行合并；若檢驗統計量I2>50%，說明各納入文獻之間異質性相對比較大，則應采用更為保守的隨機效應模型進行合并。如果存在異質性，則需尋找異質性來源，對納入的文獻進行亞組分析、敏感性分析等。利用Stata 12軟件做Begg法和Egger直線回歸對文獻發表偏倚進行評估。

結 果

一、納入文獻的基本信息

從外文數據庫和中文數據庫中共找到相關文獻57篇，根據預先制定好的納入標準，并排除研究數據重復的和不滿足Hardy-Weinberg平衡的文獻，最終納入5篇文獻，其基本信息見表1。累計哮喘組患者1 241例，均符合現公認的支氣管哮喘診斷標準，對照組患者1 005例。各研究對象的提取的信息及基因頻率，見表2。

二、異質性檢驗

各研究的Hardy-Weinberg平衡P值均>0.05，說明納入的5篇文獻所收集的人群代表性比較好。由于缺乏TT基因型的數據，故使用顯性模型GT/GG以及位點比較模型G/T的OR值和95%CI作為合并各個研究資料的效應指標，并對各模型中的文獻作異質性檢驗。經RevMan 5.3分析，顯性模型GT/GG和位點比較模型G/T中納入的各研究中不存在異質性，故兩模型均采用固定效應模型來分析。

三、TIM-3基因-574 G>T多態性與哮喘易感性的分析結果

哮喘病例組和對照組在顯性模型和位點比較模型中差異有統計學意義，結果見圖2、圖3。顯性模型GT/GG合并后的OR值為4.06(95%CI：2.34,7.05)，結果表明GT基因型的分布與哮喘的易感性有統計學意義，攜帶有GT突變基因型的個體患哮喘的風險是野生型純合子GG個體的4.06倍。位點比較模型G/T的合并OR值為4.31(95%CI：2.50,7.43)，結果說明TIM-3 -574位點上T基因的突變會增加哮喘的易感性。與野生型G等位基因相比，TIM-3 -574位點上攜帶有T基因的個人患哮喘的風險增加3.31倍。

表1 Meta分析納入的5篇文獻基本信息特征

注：Pa：為對照組的Hardy-Weinberg遺傳平衡定律統計量

表2 5篇納入文獻中基因型和等位基因頻率的分布特點[n(%)]

注：a：均數±標準差；b：年齡范圍

圖2 TIM-3基因-574 G>T多態性與哮喘易感性(顯性模型GT/GG)

圖3 TIM-3基因-574 G>T多態性等位基因與哮喘易感性(位點比較模型G/T)

四、發表偏倚

利用Stata 12對該研究納入文獻的發表偏倚情況進行定量分析。Begg法結果值為Z=1.22，P=0.221，Egger法結果值為t=3.42，P=0.042，按照α=0.1檢驗水準，兩者結果不一致，說明本文納入文獻可能存在發表偏倚。

五、敏感性分析

本文中納入的文獻之間不存在異質性，利用隨機效應模型對納入文獻的顯性模型再次合并計算，結果并未發生改變。顯性模型中剔除一篇權重最大的李際盛等[14]的研究后，利用固定效應模型進行計算，合并的OR值為5.41(95%CI：2.62,11.16)，I2=0。因此，上述處理結果均顯示本文結果較為穩定。

六、亞組分析

以年齡作為劃分，將資料病例人群分為兒童組和成人組，利用亞組分析對顯性模型進行分析，由于巫學蘭[12]這篇文獻納入的病例組和對照組人群中有成人也有兒童，故無法納入亞組分組，合并結果見圖4。兒童組的合并OR值為4.07(95%CI：1.62，10.20)，I2=0；成人組的合并OR值為3.49(95%CI，1.92,6.37)，I2=13%。說明TIM-3基因-574 G>T多態性與兒童和成人哮喘的易感性有關系。

圖4 TIM-3基因-574 G>T多態性與哮喘易感性的年齡亞組分析(顯性模型GT/GG)

討論

T細胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白(TIM)家族是T細胞Ⅰ型跨膜蛋白，其N末端有Ⅴ型Ig結構域，該結構域上有長度可變的黏蛋白結構域、包含一個與N原子連接的糖基化位點以及數個與O原子連接的糖基化位點[16]。小鼠的TIM基因家族定位于染色體11B1.1，包含TIM1-8，而人類的TIM基因家族定位于染色體5q33.2，包含3個成員，即TIM-1、TIM-3和TIM-4，其在嚙齒類動物和人類之間無論從表達情況還是功能結構都具有同源性，其余5種TIM基因只在嚙齒類動物中表達[17]。TIM-1、TIM-3、TIM-4在分子結構和功能上都具有不同的特點。TIM-1主要在Th2細胞中表達，Umetsu等[18]發現利用抗原和TIM-1單克隆抗體(TIM-1 Ig)對體外Th2細胞進行共刺激培養，可見T細胞大量增殖，IL-4分泌明顯升高，但不分泌IFN-γ；而與對照組相比，小鼠體內給予TIM-1 Ig處理后，體外分離得到的T細胞大量增殖，分泌大量的IL-4、IL-10和IFN-γ。Xie等[19]的相關性分析表明TIM-1 416G>C的基因多態性與中國漢族人的哮喘易感性有關，但5383_5397位點上插入/缺失的多態性與哮喘的發病風險無關。TIM-3主要表達于分化成熟的Th1細胞而不表達于Th2 細胞，負性調節Th1型免疫反應。Th17也有少量表達，而Th2細胞不表達[20]。Anderson等[21]研究發現TIM-3在單核細胞以及樹突狀細胞中也有表達，而且在固有免疫與獲得性免疫中TIM-3發揮著截然不同的作用。在固有免疫中，TIM-3協同Toll樣受體增加TNF-α的分泌，從而促進炎癥發展；在獲得性免疫中，TIM-3通過IFN-γ上調其配體半乳凝素-9，后者結合在Th1細胞表面的TIM-3后，可使鈣離子內流增加，從而介導Th1細胞凋亡[22]。

本文顯示TIM-3-574 G>T多態性與哮喘易感性有關，攜帶有GT突變基因型的個體患哮喘的風險是野生型純合子GG個體的4.06倍。因此，推測TIM-3-574 位點上T基因的突變可能會激活TIM-3或者增強其活性，IFN-γ分泌增多，促使半乳凝素-9上調，后者與Th1細胞表面的TIM-3結合后，可使鈣離子內流增加，Th1細胞發生鈣超載，從而介導Th1細胞凋亡，導致Th1/Th2 平衡向Th2偏移，最終導致哮喘的發生。

另外，以年齡作分組進行亞組分析，發現TIM-3-574位點上T基因的突變對兒童哮喘發病的影響可能比成人的影響更大(兒童組：OR=4.07，95%CI：1.62，10.20；成人組：OR=3.09，95%CI：1.40,6.85)，我們推測導致該結果的原因可能有兩個：①兒童免疫系統發育尚未成熟，對外來刺激反應更為敏感，TIM-3-574位點可能更容易發生突變，導致哮喘發生風險增加；②可能由于兩組樣本量不足導致結果偏差。

目前國內外有多個TIM-3-574 G>T多態性與人類支氣管哮喘的易感性相關的研究，但大部分都是中國漢族人種，對伊朗波斯人和韓國人與TIM-3基因多態性相關性的研究各有一篇[23-24]，考慮到其他人種的研究數量不足，為了排除人種的影響，故本文僅納入中國漢族地區人群的研究。本文納入的研究數目較少，每個研究納入的樣本量不夠大，人種相對單一，從而無法進一步分層分析，故存在一定局限性，尚需要更大的樣本量予以支持以及不同人種的哮喘與TIM-3基因多態性的研究。此外，本文納入的文獻NOS評分不高，未能得到每一個研究中更多的詳細信息(如巫學蘭等[12]的研究中未把研究對象分為兒童組與成人組)。因納入的文獻中未能提供有關環境的信息，也無法對基因-基因及基因-環境的交互作用進行分析，因而需要更全面更高質量評分的文獻來進一步支持研究結果和闡明哮喘的發病機制。

綜上所述，TIM-3-574 G>T單核苷酸多態性變異與中國漢族人群支氣管哮喘患病風險有高度相關性，且T基因的突變可能使兒童組的發病風險比成人組的更高。