COL1A1在胃癌中的表達及臨床意義

馬藝琿 李國琛

胃癌為全球常見的消化道惡性腫瘤，位于癌癥致死原因的第二位[1]。盡管近年來診療技術(shù)不斷進步，但是目前患者的長期生存率還有待提高，其中胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成預(yù)后較差的重要原因[2]。高通量測序及基因芯片技術(shù)的發(fā)展及公共數(shù)據(jù)集的完善，為胃癌診斷指標，治療靶點及預(yù)后評價指標的篩選提供了更多的可能性[3]。本研究對Gene Expression Omnibus（GEO）及Cancer Genome Atlas（TCGA）現(xiàn)有的一系列胃癌相關(guān)數(shù)據(jù)集進行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果提示編碼膠原蛋白的一系列基因家族存在表達異常，可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。其中Ⅰ型膠原α1（COL1A1）基因與胃癌患者的TNM分期及預(yù)后具有密切關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集納入

從Gene Expression Omnibus（GEO）下載4個獨立的胃癌患者組織標本mRNA芯片數(shù)據(jù)。4個數(shù)據(jù)集的訪問編號為GSE13861，GSE13911，GSE19826及GSE54129（具體信息見表1）。同時下載Cancer Genome Atlas中胃癌數(shù)據(jù)集（TCGA-STAD）的患者組織標本mRNA數(shù)據(jù)集臨床信息。TCGA-的數(shù)據(jù)用于分析正常組織和癌組織之間的基因差異，TNM分期與基因差異的關(guān)系及生存分析。

1.2 胃癌癌周正常組織及癌組織間差異基因的分析

使用R統(tǒng)計分析軟件結(jié)合Limma程序包利用線性模型對GSE13861、GSE13911、GSE19826及GSE54129四個數(shù)據(jù)集中胃癌癌周正常組織及癌組織間差異基因進行篩選。表達差異倍數(shù)大于2倍且P＜0.05的基因定義為具有變化的差異基因。利用韋恩圖對四個數(shù)據(jù)集中獲取的顯著變化的差異基因進行取交集操作，以便整合四個數(shù)據(jù)集的結(jié)果。

1.3 基因富集分析（Gene Ontolog，GO）及KEGG信號通路分析

對四個數(shù)據(jù)集的顯著差異基因進行取交集后整合，將得到一份整合后的癌周正常組織及癌組織間顯著差異的基因列表。對這些基因進行進一步的GO富集分析，以便明確這些基因涉及的生物學(xué)過程，功能及分子定位（細胞組分）。同時進行KEGG信號通路分析以明確這些基因參與哪些信號通路的調(diào)控。GO富集分析及KEGG信號通路富集分析使用DAVID Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis在線工具進行（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.4 蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

利用String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），對上述整合后顯著差異基因編碼的蛋白質(zhì)進行網(wǎng)絡(luò)分析，獲取各基因編碼蛋白質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件（版本號3.5.1）計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的連接度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用R統(tǒng)計學(xué)軟件（版本號3.4.2）。癌周正常組織及癌組織間的差異使用獨立樣本t檢驗及貝葉斯檢驗。TNM分期間的基因表達差異使用單因素方差分析。生存分析使用Kaplan-Meier法結(jié)合log-rank分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌癌周正常組織及癌組織間存在顯著表達差異的基因

四個GEO數(shù)據(jù)集中胃癌癌周正常組織與癌組織相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表達倍數(shù)＞2或＜0.5且P＜0.05）的基因個數(shù)及上調(diào)/下調(diào)情況如表1所示。通過對四個數(shù)據(jù)集取交集發(fā)現(xiàn)，共105個基因在四個數(shù)據(jù)集中均存在顯著表達的差異。其中34個基因上調(diào)，71個基因下調(diào)。

2.2 胃癌癌周正常組織及癌組織間差異表達基因的富集分析、相關(guān)信號通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

本研究四個數(shù)據(jù)集中均存在顯著表達差異的105個基因進行了Go基因富集發(fā)現(xiàn)，對這些基因參與的生物學(xué)過程，分子功能及細胞定位（細胞組分）進行了分析（圖1）。結(jié)果顯示一些基因在生物學(xué)過程、分子功能及細胞定位等方面均參與細胞外基質(zhì)的調(diào)控相關(guān)，有趣的是基因多來自膠原調(diào)控基因家族，包括COL1A1，COL1A2，COL3A1，COL6A3，COL5A2，COL10A1，COL4A1 及COL4A2等。同時我們對上述105個基因進行了KEGG信號通路富集分析，這些基因涉及的主要信號通路見圖1，除細胞外基質(zhì)通路外，PI3K-AKT等信號通路也與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這些證據(jù)提示這些差異表達的基因在胃癌中扮演一定的角色。蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)這105個基因編碼的蛋白間存在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，其中COL1A1基因編碼的蛋白連接度最大（連接度=13），提示COL1A1基因在該網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。

2.3 COL1A1在胃癌組織中的表達及臨床意義

四個GEO數(shù)據(jù)集及TCGA數(shù)據(jù)集中（圖2），COL1A1均在胃癌癌組織中存在高表達，與癌周組織相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。TCGA數(shù)據(jù)集中COL1A1 mRNA水平在擁有較晚TNM分期（2期以上）的患者中存在高表達（圖3），并且與患者的生存率具有關(guān)系（圖4），即COL1A1較高的患者，十年總體生存率較低（P＜0.05，風(fēng)險比=1.5）。

3 討論

精準醫(yī)療和個體化醫(yī)療的發(fā)展需要明確更多胃癌相關(guān)基因的作用及其與胃癌患者臨床特征的關(guān)系[4-5]。近十年來，RNA測序及基因芯片等技術(shù)不斷成熟，在準確度，效率增加的同時，技術(shù)費用又所下降，形成了癌癥相關(guān)的大數(shù)據(jù)[6]。利用生物信息學(xué)手段挖掘這些大數(shù)據(jù)，可以方便的找到可能與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。相比傳統(tǒng)研究，更加經(jīng)濟且有效縮短了研究周期[4]。

通過差異分析及整合，我們發(fā)現(xiàn)105個基因在四個GEO胃癌數(shù)據(jù)集中的表達特征一致，其中34個基因在胃癌組織中上調(diào)，71個基因下調(diào)。通過GO富集分析及KEGG信號通路分析，可以將這105個基因按照其功能進行歸類，達到對差異基因進行注釋和分類的目的，同時發(fā)現(xiàn)這些基因參與哪些信號通路。在本研究我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織105個差異表達的基因參與的生物學(xué)過程主要包括細胞黏附，細胞外基質(zhì)的調(diào)控。KEGG信號通路富分析排名靠前的信號通路主要包括PI3K-Akt通路及細胞外基質(zhì)調(diào)控通路。這些生物學(xué)功能及通路均和腫瘤細胞的增殖和遷移有關(guān)，很大程度上決定了腫瘤的侵襲程度和患者的預(yù)后[7-8]。本研究重點關(guān)注了細胞外基質(zhì)調(diào)控的相關(guān)基因，有趣的是這些基因均來自膠原形成相關(guān)的基因家族（COL基因家族），包括COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL6A3、COL5A2、COL10A1、COL4A1 及 COL4A2[9]。

表1 四個GEO胃癌數(shù)據(jù)集中癌周組織及癌組織間具有顯著表達差異的基因信息

圖1 胃癌組織中105個差異基因的GO基因富集分析及KEGG信號通路富集分析結(jié)果（富集分數(shù)前5位）

圖2 COL1A1 mRNA在四個GEO胃癌數(shù)據(jù)集及TCGA胃癌數(shù)據(jù)集中的表達水平*P＜0．05 與癌周組織相比

圖3 COL1A1表達與胃癌患者分期及預(yù)后的關(guān)系

胃癌發(fā)展的過程是與腫瘤微環(huán)境互相作用的動態(tài)過程。胃癌的生存及遷移均與微環(huán)境關(guān)系密切[8-10]。而膠原是胃癌細胞的細胞外間質(zhì)的主要成分，也是間質(zhì)微環(huán)境的主要組成。膠原可以為腫瘤細胞提供生長依附和支架，誘導(dǎo)腫瘤細胞的移行[11-12]。證據(jù)表明在胃癌發(fā)生時膠原的合成增多[13]。本研究也在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)了上述膠原相關(guān)基因的表達增加。膠原可以影響E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞間黏附復(fù)合物的形成及解聚，從而影響腫瘤細胞的擴散和增殖。還有一些膠原如Ⅰ型及Ⅲ型膠原還可以機會整合信號通路，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[9,12]。本研究通過對差異基因進行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，上述的COL基因似乎更為重要，表現(xiàn)為與其他基因編碼的蛋白存在廣泛聯(lián)系。特別是COL1A1基因，其編碼的蛋白質(zhì)在構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)中，連接度最高。因此我們認為COL1A1可能是一個參與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。在四個GEO數(shù)據(jù)集及TCGA數(shù)據(jù)集中，COL1A1均在胃癌組織中高表達，且結(jié)合TCGA的臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)COL1A1在TNM分期較晚的患者中，表達較高且較高的COL1A1預(yù)示著較低的十年總體生存率，提示COL1A1是胃癌患者預(yù)后較差的一個風(fēng)險因素。

總之，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)了一系列可能參與胃癌發(fā)生發(fā)展的基因，特別是一些參與膠原形成與細胞外基質(zhì)相關(guān)的基因在胃癌組織中存在明顯的表達差異。這些基因可能作為胃癌的診斷指標，治療靶點或者預(yù)后評估標志物。其中COL1A1與胃癌患者的TNM分期及預(yù)后相關(guān)。