右美托咪定預處理對大鼠肺缺血-再灌注損傷時氧化應激反應及細胞凋亡的影響*

孔嵐，白玉，韓圣娜

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，鄭州 450008；2.鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，鄭州 450002)

肺缺血-再灌注損傷是造成急性肺損傷的常見原因，多見于失血性休克、肺移植、體外循環(huán)手術、心臟驟停復蘇等。研究表明，肺組織氧化應激反應和細胞凋亡與肺缺血-再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]，右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，有研究顯示該藥可減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷[2-3]，但機制尚不明確。筆者在本實驗研究右美托咪定預處理對大鼠肺缺血-再灌注損傷的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠，2個月齡，雄性，體質量240～300 g，由鄭州大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫) 2017- 0009，實驗動物合格證號： HG0016。 飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境，相對濕度 40%～70%，溫度20～26 ℃，人工光照，晝夜明暗交替，空氣潔凈度10 000級，落下細菌數(shù)≤每皿3個，噪聲≤60 db，自由攝食、飲水，建模前12 h禁食，本研究已獲得鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院動物倫理委員會批準同意。

1.2藥品與試劑 右美托咪定(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20170702，規(guī)格：1 mL：100 μg)；丙二醛(MDA)試劑盒(批號：1508)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：1672)均購自南京建成科技有限公司；肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司，批號：H32035851，規(guī)格：2 mL：12500 U)，B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 associated X protein，bax)、 B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，bcl-2)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(中國碧云天生物技術研究所，批號分別為C1256，C1305，C1375，C1298)，二抗工作液(中國碧云天生物技術研究所，批號：SC6753，SC7876，SC8562，SC5219)。

1.3儀器與設備 HX-100E小動物呼吸機(中國成都泰盟科技有限公司)，電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.4動物分組與模型的制備 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為3組(n=16)，假手術組(S組)只開左胸不夾閉肺門；缺血-再灌注(IR)組夾閉左肺門使左肺缺血45 min，再恢復灌注2 h；右美托咪定預處理+缺血-再灌注組(D組)夾閉左肺門前20 min經(jīng)股靜脈注射右美托咪定20 μg·kg-1。 參照改良的EPPINGER法[4]建立肺缺血-再灌注模型，大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，置于有保溫設備的實驗臺上仰臥位固定，氣管切開后插管，接小動物呼吸機，機械通氣，潮氣量雙側肺通氣15～20 mL·kg-1，單側肺通氣8～10 mL·kg-1，通氣頻率60次·min-1，吸氣與呼氣比為1：2。維持呼氣末二氧化碳分壓(end tidal carbon dioxide tension，PETCO2)4.66～5.98 kPa，股靜脈置入24 G靜脈留置針，便于給藥和輸液。修剪左胸部皮毛，涂抹脫毛劑去毛，75%乙醇、碘酊消毒左胸部皮膚，逐步分離肌肉、筋膜，切斷肋骨后打開胸腔，暴露左肺，無損傷鉗游離左肺門，靜脈注入肝素鈉50 U，10 min后用無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門45 min，可見左肺顏色從紅色變?yōu)榘导t色，說明缺血成功，45 min后松開血管夾恢復血供，左肺由暗紫色轉為紅色，表明再灌注成功。再灌注2 h后處死大鼠，留取左肺組織。制備模型過程中使用BWZ-50C6微量泵(浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司)靜脈泵注乳酸鈉林格液6 mL·kg-1·h-1。

1.5測定大鼠肺組織濕/干重比(Wet/Dry，W/D)以及總肺含水量(total lung water，TLW) 處死大鼠，取左肺組織，用0.9%氯化鈉溶液充分漂洗，多余水分用濾紙吸干，稱重量即為濕重(W)；80 ℃恒溫箱中烘干48 h，稱干重(D)，計算肺W/D。TLW=(W-D)/D。另取部分左肺組織置于甲醛溶液，石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察、比較各組肺組織病理學特征。

1.6肺組織MDA含量和SOD活性測定 取部分左肺組織，制備10%組織勻漿，低溫離心后取上層懸液，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.7Western blotting測定bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達 取部分肺組織，研磨為組織勻漿，高速低溫離心，取上清液，采用Bradford法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，37 ℃反應后分別加入bax、caspase-3、bcl-2一抗和GAPDH一抗4 ℃下過夜，加入二抗室溫下反應1.5 h。化學發(fā)光、顯影、定影。Quantity One圖像分析軟件進行半定量分析。

2 結果

2.1肺組織W/D與TLW 與S組比較，其他兩組W/D升高，差異有統(tǒng)計學意義 (F=98.152，94.131，P<0.01)，TLW均升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=96.172，92.386，P<0.01)；與IR組比較，D組W/D、TLW明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=105.163，101.231，P<0.01)。見表1。

2.2肺組織結構 S組大鼠肺組織結構未見明顯損傷性改變，肺泡及肺泡壁結構完整，肺間質無水腫，無中性粒細胞浸潤；IR組肺泡結構破壞嚴重，肺泡內及肺泡壁充血實變，肺間隔增厚，肺泡腔和間質嚴重水腫，并可見大量紅細胞漏出，中性粒細胞明顯浸潤。D組肺組織損傷程度明顯減輕，肺泡及肺間質僅少量中性粒細胞浸潤。

表13組肺組織W/D與TLW測定結果

組別大鼠數(shù)W/DTLWS組164.31±0.283.29±0.26IR組165.99 ±0.41*14.71±0.39*1D組165.30±0.12*1*24.23±0.21*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.3肺組織MDA含量及SOD活性比較 與S組比較，其他兩組肺組織MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=91.769，95.832，P<0.01)；SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=104.335，97.356，P<0.01)；與IR組比較，D組肺組織MDA含量降低(F=95.534，P<0.01)，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=96.769，P<0.01)，見表2。

表23組大鼠肺組織MDA含量與SOD活性測定結果

組別大鼠數(shù)MDA/(nmol·mg-1)SOD/(U·mg-1)S組160.372±0.019 112±5 IR組160.671±0.036*1 61±6*1D組160.536±0.059*1*2 75±8*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.4肺組織bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達比較 與S組比較，其他兩組肺組織bax蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=102.535，99.765，P<0.01)，caspase-3蛋白表達升高(F=103.325，95.126，P<0.01)，bcl-2蛋白表達降低(F=98.635，95.396，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與IR組比較，D組肺組織bax、caspase-3蛋白表達降低(F=97.215，94.156，P<0.01)，bcl-2蛋白表達升高(F=106.235，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

3 討論

肺缺血-再灌注損傷是臨床常見問題，也是急性肺損傷的主要原因之一。預防和減輕肺缺血-再灌注損傷一直是臨床研究熱點。右美托咪定是一種高選擇性α2-腎上腺素受體激動藥，目前已發(fā)現(xiàn)其對缺血-再灌注所引起的臟器損傷具有良好的保護作用，機制與抗氧化應激、抑制炎癥細胞因子釋放以及抗細胞凋亡等有關[5-6]。目前臨床圍術期右美托咪定多預先給藥，因此本研究亦采用右美托咪定預處理方式，以更接近臨床實踐。筆者根據(jù)相關報道選取右美托咪定濃度[7]，即于缺血前20 min給予右美托咪定20 μg·kg-1。筆者在本研究采用改良EPPINGER[4]法建立大鼠肺缺血-再灌注模型，結果顯示，IR組肺組織W/D、TLW均升高，肺組織形態(tài)、結構均發(fā)生明顯損傷性改變，提示大鼠肺缺血-再灌注損傷模型制備成功。D組肺組織病理損傷明顯輕于IR組，提示右美托咪定能減輕肺組織損傷。

表33組大鼠肺組織bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達情況

組別大鼠數(shù)baxcaspase-3bcl-2S組1698.76±12.3799.98±13.1699.85±11.02IR組16234.12±26.35*1197.75±21.08*138.67±5.18*1D組16172.23±16.87*1*2143.79±14.25*1*268.91±7.76*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

組織器官發(fā)生缺血-再灌注時，體內氧自由基生成增多，膜磷脂中多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生脂質過氧化反應，產(chǎn)生大量有毒脂質過氧化產(chǎn)物，造成并加重組織損傷[8-11]。SOD是體內最主要的抗氧化酶和自由基清除劑，可以將脂質過氧化產(chǎn)物(如MDA等)歧化為過氧化氫和水，清除氧自由基并終止自由基病理性連鎖反應，保護細胞免受損傷，其活性高低可反映機體清除氧自由基的能力[12]。MDA含量可直接反映機體脂質過氧化反應的程度，間接反映細胞損傷的程度[13]。本研究中，與S組比較，IR組肺組織MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，說明大鼠肺缺血-再灌注損傷過程有氧化應激反應參與；D組肺組織MDA含量明顯較IR組降低，SOD活性明顯較IR組升高，提示右美托咪定可能通過抑制氧化應激反應減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷。

研究表明，在IR損傷中，細胞凋亡是再灌注后炎性反應和組織損傷的重要因素[14]。因此細胞凋亡在肺缺血-再灌注損傷中具有重要作用[15]。bcl-2和bax對調節(jié)細胞凋亡非常重要，bcl-2使細胞色素C釋放減少，具有抑制細胞凋亡作用，bcl-2介導的抑制凋亡作用能被bax所拮抗，兩者處于平衡狀態(tài)。缺血-再灌注會影響細胞中這種平衡，導致細胞色素C大量釋放進入胞質，引起細胞caspase凋亡途徑被激活，發(fā)生細胞凋亡、組織功能損傷[16]。本研究中，與S組比較，IR組大鼠肺組織bax、caspase-3表達量升高明顯，bcl-2表達降低明顯，提示缺血-再灌注可造成肺組織細胞過度凋亡。D組大鼠肺組織bax、caspase-3表達量明顯較IR組低，bcl-2表達量明顯較IR組高。提示右美托咪定可以抑制細胞凋亡。

總之，右美托咪定可以通過抑制氧化應激反應及細胞凋亡來減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷。