基于高速逆流色譜的大極性海參多肽分離方法研究

全凱軍，段文達，王 玉，裴 棟，黃新異*，邸多隆*

1中國科學院蘭州化學物理研究所 西北特色植物資源化學實驗室，蘭州 740000；2中國科學院大學，北京 100049

海參多肽(Sea cucumber polypeptide)是以海參為原料，經蛋白酶酶解后分離得到的具有多種功能特性的生物活性物質。研究發現海參多肽具有抗氧化[1]、降血壓[2]、降血脂[3]、抗疲勞[4]、抗癌[5]以及鎮痛[6]等生物活性，在食品、醫藥、保健品等行業具有很大的應用價值。但海參多肽活性的研究多以混合肽為研究對象，存在生物活性物質基礎不明確的問題。目前對海參多肽的分離純化主要是對其進行脫鹽和脫色處理得到純度較高的粗多肽[7,8]和使用不同技術從分子量角度進行分離純化得到具有高純度的多肽單體[9]。上述分離技術使得海參的營養價值得到更好地研究和應用，但依然存在分離不系統、微量活性成分易丟失、制備量小等問題，這就限制了它的進一步開發利用，因此急需建立一種新的方法實現對海參多肽較系統地分段處理，為海參多肽生物活性物質基礎研究和系統分離提供技術支持。

高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC) 是在液-液分配基礎上建立的一種連續的分配色譜技術，與其他柱色譜技術相比，具有無不可逆吸附、無分解變性、活性保留、制備量大和溶劑系統選擇多等優點[10]，被作為一門高效的制備或半制備分離技術廣泛用于天然產物活性物質的制備分離[11-13]。應用逆流色譜技術對多肽分離研究也已有眾多報道[14-16]，但上述研究主要是采用特定逆流色譜設備用雙水相體系或使用特別的逆流色譜技術如PH區帶精制逆流色譜[17]、螺旋柱逆流色譜[18]等進行單肽的分離制備或對多肽標準品進行方法學研究，而使用HSCCC對多肽粗品進行系統分段的研究卻鮮有報道。此外，目前使用最廣泛的高速逆流色譜，又叫J型逆流色譜[19]，是建立在一種特殊的同步行星式運動模式基礎上能夠實現對常規中小極性天然物質的快速、高效分離，但由于其運動模式的限制，對適合多肽分離的大極性溶劑體系如雙水相很難得到有效保留，因此對多肽等大極性化合物分離效果不佳，這就極大限制了高速逆流色譜技術在大極性物質如多肽的系統分離和活性篩查研究中的應用[20]。

本文通過對28種逆流色譜中常用的HEMWat溶劑體系極性規律進行分析，探討了無法用J型HSCCC實現對大極性多肽有效分離的原因，進而建立一種基于分離物質理化性質選擇適宜的溶劑改性劑實現對大極性分離物質有效分段的樣品前處理方法，并對海參多肽樣品進了分段研究，為海參多肽的最佳活性物質的篩選追蹤和進一步的開發利用提供了技術支持，同時也為使用HSCCC實現其他大極性物質如蛋白質多糖的分離提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TBE-300C型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司,中國)；NU3000紫外檢測器和NP7000 恒流泵(江蘇漢邦科技有限公司，中國)；Easy Chrom工作站(江蘇漢邦科技有限公司，中國)；HX-2050 恒溫循環器 (北京博醫康實驗儀器有限公司，中國)；BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士步琪有限公司，瑞士)。1260 HPLC色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國)，色譜柱為：Spherisorb C18(4.6 mm×250 mm,5 um,柱號：E2721217)。表1和表2中所列的HEMWat溶劑體系的配比數據是由英國Dynamic Extractions 有限公司提供。

1.1.2 試劑

高速逆流色譜分離所用到的試劑包括：分析級正丁醇(重慶化學試劑有限公司)；超純水是由Spring-R10水純化系統(中國廈門科學儀器有限公司)制備得到；分析純乙酸和三乙胺(天津大茂化學式劑廠)；實驗所用海參多肽由青島市資源化學與新材料研究中心提供，分子量范圍在800～3 000 Da。

1.2 HEMWat溶劑體系極性分析

HEMWat溶劑體系是逆流色譜中一類比較有代表性的溶劑體系，其溶劑組成如表1所示。為實現溶劑系統的科學配置,DE研發團隊利用氣相色譜分離分析技術對HEMWat溶劑體系分層后的組成進行了研究，建立了一套多元溶劑體系上下相體系的科學配制新方法，其組成情況如表2所示。本文根據羅氏極性公式：P=X1P1+X2P2+X3P3+…+XnPn，以Rohrschneider Snyder為極性參數(表3)對HEMWat溶劑體系28個不同組成的兩相溶劑系統整體和單相極性分別進行計算并對其規律進行分析。

續表1(Continued Tab.1)

序號No.正己烷Hexane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water序號No.正己烷Heptane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water97.1442.867.140.0042.862340.0010.0040.000.0010.00108.3341.678.330.0041.672441.678.3341.670.008.331110.040.0010.000.0040.002542.867.1442.860.007.141212.537.5012.500.0037.502645.005.0045.000.005.001314.2935.7114.290.0035.712747.502.5047.500.002.501416.6733.3316.670.0033.332850.000.0050.000.000.00

表2 HEMWat各溶劑體系中每種組分的組成比例

表3 HEMWat體系中各溶劑的Rohrschneider Snyder極性值

1.3 改性試劑的確定和優化

改性劑的選擇是通過分析海參多肽的理化性質，選擇能夠影響其分子存在形式的物質作為潛在改性劑。以能夠模擬有機相的正丁醇/乙酸乙酯/水(5∶2∶1)為測試溶劑，在多個10 mL透明玻璃試管中分別加入6 mL測試溶劑和2 mg海參多肽粗品，然后逐一加入1 mL備選改性劑，觀察海參多肽粗品在測試液中的溶解情況,原理如圖1 所示，能夠促進樣品在測試溶劑中溶解的改性劑即為適宜的改性劑。

圖1 改性試劑的篩選原理圖Fig.1 The schematic of screening the solvent modifier

1.4 分離條件的確定

本論文的目的在于建立一個基于溶劑改性劑快速篩選策略使用J型高速逆流色譜對大極性海參多肽按照極性差異進行系統分段的樣品前處理技術，且此類大極性化合物的K值的準確測定本身存在技術難題，因此直接選擇極性溶劑系統水/正丁醇為基準體系，以固定相保留率為首要判斷指標，對水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三個溶劑系統進行分離測試篩選，使用篩選后的最優溶劑系統對流速(4、8、10、20 mL/min)進行優化。

1.5 酸堿交替分離

多肽是由不同氨基酸組成，因此由成百上千多肽組成的混合肽不會僅具有單一的酸堿性。1.3中描述的篩選方法是根據混合肽整體表現出來的性質去選擇適宜的添加劑，如海參粗多肽由于整體顯酸性因此選擇乙酸作為改性劑，但其中有部分化合物是顯堿性的，在加入乙酸的性溶劑系統中以解離形式存在，趨向與溶解在下相中被優先洗脫出來，形成一個還有較多顯堿性肽的混合組份，因此可通過選擇極性稍大的溶劑系統，改用堿性三乙胺作為改性劑對由第一步分離獲得的第一個極性段進行二次分離，由于三乙胺的加入可使它們以分子形式存在，促進其在有機相中的分配，從而實現二次分離，兩步綜合即為酸堿交替分離。

1.5 HSCCC所得組份HPLC分析

對經HSCCC分離所得到的各組分進行HPLC分析，色譜條件如下：流動相A為含有0.1%三氟乙酸水溶液，B為色譜乙腈；梯度洗脫： 0～10 min,10～30% B ；10～20 min,30%B;流速1.0 mL/min;檢測波長:220 nm和 280 nm;進樣體積:20 μL。

2 結果與分析

2.1 HEMWat溶劑體系極性分析

根據1.2方法，使用羅氏極性公式對28個HEMWat溶劑系統的整體極性和單相極性分別進行計算，結果如圖2所示：28個溶劑系統分層后的單相極性與整體極性保持相同的變化趨勢，如圖2A所示。以Rohrschneider Snyder極性參數的計算結果顯示：此體系中上相極性范圍：0.22～4.75，下相極性范圍：下相：4.93～9.74。通過用下相極性減去上相極性得：28個溶劑系統上下相極性差值基本一致(約為5左右)，如圖2B所示，也就是說逆流色譜溶劑系統分層后上下相極性具有一個相對穩定的差值，這也是兩相能夠分層的一個必要條件。

2.2 改性試劑的篩選依據和結果

逆流色譜能夠實現有效的首要前提是分離物質在所選溶劑系統的上下相中產生適宜的分配(即0.5

圖2 HEMWat溶劑體系極性分析結果及其分布規律Fig.2 The polarity result of the HEMWat solvent systems and its distributing characteristies

2.3 分離條件的確定

實驗發現TBE-300C對水/正丁醇體系的保留能力不佳，這是由于正丁醇粘度較高且易與水產生乳化，因此導致固定相的保留不穩定且平衡后色譜峰基線波動較大，尤其在較高流速下固定相保留更差。因此在兼顧分離效果的基礎上重點考慮固定相的保留，對水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三個溶劑系統和4、8、10、20 mL/min四個流速進行測試，最終選擇水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶3∶2)為基礎溶劑系統，4 mL/min為分離流速，此時固定相保留率可達到55%～60%。需要說明的是，4 mL/min的流速未能發揮TBE-300C分離快速的優勢，但多肽化合物極性較大，出峰時間較快，總分離時間均在1小時內，因此可以接受。第一步分離最終色譜條件為：水/正丁醇/乙酸乙酯/乙酸(5∶3∶2∶0.5)溶劑系統上相為固定相，下相為流動相；儀器轉速為900 rpm,流速為 4 mL/min，由頭到尾洗脫，檢測波長為220 nm,進樣體積為10 mL,樣品濃度為 5 mg/mL。因第一步分離所得M是最先洗脫出的組份極性較大，因此在對其進行二次分離時選擇極性更大的水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)為溶劑系統用于該組分的分離，其他條件同第一步分離。

2.4 海參多肽分段結果

由圖3 A可知，通過第一步分離，可將海參多肽樣品分為4個組份(M、1、2 、3,280 nm下)，其中M組份還存在明顯的肩峰，表明其還存在進一分離的可能性，因此在以水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)為溶劑系統對M組份進行二次分離，由于三乙胺的加入，使原來部分具有堿性物質的以分子形式存在，促進了其在上相中的分配，經此次分離，由M組份中進一步得到5個組份，如圖3 B所示。因此，通過酸堿改性劑的交替加入，通過兩步分離，成功將海參多肽粗品細化為8個具有不同極性的片段。各片段HPLC分析結果如圖4所示，各組分的保留時間和組成都存在差異。HSCCC和HPLC是基于不同的分離機理，HSCCC是按照極性順序洗脫，而HPLC則是存在復雜的機理，因此在HPLC保留時間接近的化合物極性也可能存在差異，因此HSCCC與制備型HPLC可以正交用于物質的系統分離。此外，所分離得到的所有組份經茚三酮顯色反應鑒定，各組分經茚三酮顯色后均出現紫色斑點，判斷含有多肽樣品。

圖3 海參多肽樣品酸堿交替洗脫分離結果的逆流色譜圖譜Fig.3 The HSCCC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

圖4 海參多肽樣品經HSCCC分段后各組份HPLC圖譜Fig.4 The HPLC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

3 結論

本文通過對逆流色譜溶劑系統極性分布規律的研究，得出無法用J型高速逆流色譜對大極性物質實現有效分離的原因是：(1)J型高速逆流色譜由于運動模式受限對適宜多肽分離的雙水相體系保留太差；(2)對于能夠保留的常規溶劑體系，大極性化合物幾乎單一的分配到溶劑系統下相，難以滿足逆流色譜分離所要求的分離物質在兩相中分配合理(即0.5