H2O2預處理結合微生物發酵提取玉米芯木聚糖的工藝研究

傅 杰，王 園，王瑞芳，陳秋燕，郭俊清，馮 霞，安曉萍*，齊景偉*

1內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2內蒙古優牧特農牧科技股份有限公司，呼和浩特 010010

木聚糖是植物細胞中半纖維素的重要組成成分，是自然界中第2豐富的可再生物質[1]。木聚糖具有廣泛的生物活性，如調節免疫、抗腫瘤、降血糖、益生等[2-5]。隨著社會對木聚糖需求的日益增加，尋求一種高效快速的木聚糖提取、制備技術已成為食品添加劑行業發展的需求。

玉米芯作為一種豐富、廉價、富含半纖維素的玉米加工副產物，常用作木聚糖提取的理想原料。然而，自然狀態下玉米芯的纖維素、半纖維素和木質素交聯在一起，形成了致密的纖維結構。為了能有效地從玉米芯細胞壁中提取木聚糖，常采用物理法、化學法、生物法以及三種方法的結合利用的提取方法。本實驗室前期已對菌酶協同發酵法提取玉米芯木聚糖進行了研究，發現枯草芽孢桿菌與釀酒酵母1∶9的比例發酵玉米芯的同時，添加纖維素酶量1 000 U/g，產物中木聚糖含量可達1.421 mg/g，與對照組相比提高了257%[6]。但此研究結果所得玉米芯木聚糖含量遠低于其他方法[7，8]。為了更有效地從玉米芯中提取木聚糖，本研究采用微生物發酵結合H2O2預處理的方法提取玉米芯木聚糖，并利用SEM法初步探討了該方法提高玉米芯木聚糖含量的原因，以期為微生物發酵玉米芯生產木聚糖提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)和釀酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119)均購買于中國微生物菌種保藏中心。

原料：玉米芯原料購買于市場，粉碎過篩(20目)。

培養基：營養肉湯培養基、麥芽汁培養基均購買廣東環凱微生物科技有限公司。

試劑：D-木糖：分析標準品，Aladdin公司。過氧化氫、尿素、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

儀器與設備：SW-CJ超凈工作臺、上海新苗醫療器械；GX2型智力光照培養箱、寧波東南儀器有限公司；QYC-200恒溫培養搖床、上海福瑪實驗設備有限公司；TG16-WS臺式高速離心機、湖南湘儀儀器開發有限公司；微孔板分光光度計、美國伯騰儀器有限公司；JSM-6390LV掃描電鏡、JEOL公司；IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜、Eiko公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

釀酒酵母菌：將冷凍保存的釀酒酵母經過麥芽汁瓊脂培養基活化48 h后，挑取生長良好的單個菌落，接種于釀酒酵母種子液培養基中，置于28 ℃，120 rpm的搖床中培養24 h，備用。

枯草芽孢桿菌：將冷凍保存的枯草芽孢桿菌經營養肉湯瓊脂培養基活化24 h后，挑取生長良好的單個菌落，接種于枯草芽孢桿菌種子液培養基中，置于36 ℃，120 rpm的搖床中培養24 h，備用。

1.2.2 H2O2預處理玉米芯

分別將0%、0.5%、1%、2%、4%的雙氧水(相對于原料)與2 mL蒸餾水、1 g玉米芯粉混勻，室溫下放置0、0.5、1、2、4 h。然后經高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，滅菌條件為121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量為測定指標，確定出H2O2的添加量和預處理時間。

1.2.3 預處理方法對比

分別將4%H2O2、0.5%尿素以及4% H2O2加0.5%尿素(相對于原料)與2 mL蒸餾水、1 g玉米芯粉混勻，室溫下放置1 h。經高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，滅菌條件為121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量為測定指標，確定出最適預處理方法。

1.2.4 微生物發酵玉米芯

將經預處理與未預處理的玉米芯分別進行發酵，其發酵條件為：發酵菌種釀酒酵母和枯草芽孢桿菌接種比例為9∶1，發酵底物由15 g玉米芯、0.15 g尿素、0.15 g葡萄糖、18 g水組成，發酵溫度36 ℃，發酵時間48 h，接種量為10%。以木聚糖含量為測定指標，考察H2O2預處理對微生物發酵提取玉米芯木聚糖的影響。

1.2.5 單因素優化微生物發酵提取木聚糖的培養基組成

分別研究含水量、尿素添加量和葡萄糖添加量對玉米芯木聚糖提取率的影響。含水量為45%、50%、55%、60%；尿素添加量為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%；葡萄糖添加量為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%。

1.2.6 響應面優化微生物發酵提取木聚糖的培養基組成

在單因素試驗基礎上，確定含水量(A)、葡萄糖添加量(B)、尿素添加量(C)的取值范圍，采用Box-Behnken試驗設計三因素三水平的響應面優化試驗，以發酵底物中玉米芯木聚糖得率(Y)為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行分析，得出微生物發酵提取玉米芯木聚糖的培養基組成。響應面因素設計見表1。

表1 響應面分析試驗因素與水平

1.2.7 木聚糖含量測定

將處理后的玉米芯于45 ℃烘箱中烘干(24 h)，1 g干燥玉米芯加入10 mL蒸餾水，80 ℃水浴30 min后，放于5 000 rpm的高速離心機中離心15 min，上清液備用。取1 mL上清液，加入6 mol/L鹽酸3 mL，沸水浴2 h，迅速冷卻，用6 mol/L的NaoH中和水解液并調節pH為中性，用蒸餾水稀釋至10 mL[9]。本實驗以木聚糖為標準品，采用DNS法測定還原糖含量，再將其乘以稀釋倍數10和換算系數0.88，即得到木聚糖含量[10]。

1.2.8 掃描電鏡

樣品用IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜后，使用JSM-6390LV掃描電鏡直接上機觀察。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用SAS9.2統計軟件進行ANOVA單因素方差分析，并用Duncan’s 法進行多重比較，P<0.05為差異顯著；采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 H2O2預處理對玉米芯木聚糖含量的影響

玉米芯經濃度0.5%～4% H2O2預處理不同時間后，木聚糖含量變化見表2。由表2可見，隨著H2O2處理玉米芯的時間延長，木聚糖含量呈現先升高后降低的變化，各濃度H2O2預處理組中木聚糖含量最高均出現在處理1 h。且玉米芯木聚糖含量隨著H2O2濃度增加而增加，在4% H2O2處理玉米芯1 h后，木聚糖含量可達40.21±0.21 mg/g，較未經H2O2處理組提高了98.56%(20.25±0.83 mg/g)。因此選擇4%H2O2預處理玉米芯1 h。

表2 H2O2濃度與處理時間對玉米芯木聚糖含量的影響

注：與空白對照組相比，*表示存在差異顯著(P<0.05)；a,b,c同列數據肩標不同表示差異顯著(P<0.05);肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note:Compared with control,*indicated significant difference (P<0.05 );a,b,c in the same column,values with different superscripts indicated significant difference (P<0.05 );While with the same superscripts indicated no significant difference (P>0.05 ).Same as below．

2.2 H2O2結合尿素預處理對玉米芯木聚糖含量的影響

如圖1所示，玉米芯經H2O2、尿素、H2O2+尿素處理后，木聚糖含量分別達44.27 mg/g、31.11 mg/g、37.21 mg/g，木聚糖含量均較玉米芯原料有顯著提高，且H2O2處理組的木聚糖含量最高。盡管尿素具有破壞纖維素、木質素的致密結構[11]，促進木聚糖的釋放，但本研究中玉米芯經H2O2處理釋放木聚糖效果優于尿素處理和H2O2+尿素處理，因此，選擇H2O2對玉米芯進行預處理。

2.3 H2O2預處理對微生物發酵提取玉米芯木聚糖的影響

預處理的目的是破壞木質纖維素結構、脫去木質素或半纖維素，同時增大微生物與底物的接觸面積，提高發酵效率。玉米芯經H2O2預處理后，利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發酵，其產物中木聚糖含量分別為52.72 mg/g，而未經預處理的玉米芯發酵產物中木聚糖含量為20.95 mg/g(如圖2)，H2O2預處理顯著提高了微生物發酵效率(P<0.01)，發酵產物中木聚糖含量提高了151.64%。

圖1 不同預處理對木聚糖含量的影響Fig.1 Effect of Different Pretreatments on Xylan Content

圖2 H2O2預處理對微生物發酵玉米芯中木聚糖含量的影響Fig.2 Effect of H2O2 pretreatments on the content of xylan from microbial fermentation corncob

2.4 單因素試驗結果

圖3 含水量(a)、尿素(b)和葡萄糖(c)對發酵玉米芯中木聚糖含量的影響Fig.3 Effects of water content,urea and glucose on the contents of xylan from fermented corncob

由圖3 a可知，含水量對發酵產物中木聚糖含量有一定的影響，隨著培養基中含水量的增加，發酵產物中木聚糖含量呈現先增大后減少的趨勢。含水量50%時，木聚糖含量達到最高值60.04 mg/g，顯著高于其他料水比(P<0.05)。因此，選擇培養基中含水量為50%。同理由圖3 b和圖3 c可得，確定出尿素添加量為0.25%、葡萄糖添加量為0.75%，在此條件下，木聚糖含量可達65.06 mg/g。由SAS 9.2軟件方差分析可知，三因素不同添加量對木聚糖含量的影響均顯著(P<0.05)。

2.5 響應面優化結果與分析

2.5.1 響應面結果

在單因素結果基礎上，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計及分析方法對含水量(A)、葡萄糖添加量(B)和尿素添加量(C)進一步優化，試驗結果見表3。

利用Design-Expert 8.0軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=65.85+2.62A+0.11B+2.01C+1.38AB-0.65AC+1.04BC-4.09A2-1.62B2-3.62C2。

表3 Box-Behnken響應面優化試驗設計及結果

回歸模型各項的方差分析見表4。由表4可知，該模型P值為0.037 8，表明回歸模型極顯著，失擬項的P值為0.758 8大于0.05，模型失擬不顯著，試驗誤差小[12]，由此說明用該模型對微生物發酵提取玉米芯木聚糖的培養基組成進行優化是可行的。由F值可知，三因素對發酵產物中玉米芯木聚糖含量影響的順序為：含水量(A)>尿素添加量(C)>葡萄糖添加量(B)。

表4 回歸模型方差分析結果

注:*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)。

Note:*Significant difference (P<0.05);**extremely significant difference (P<0.01).

2.5.2 響應面分析

圖4為各交互因素對發酵產物中木聚糖含量影響的響應面。由圖4可知，兩因素交互作用對木聚糖含量影響并不顯著(P>0.05)，圖4(A)表示，隨著含水量的增加，木聚糖含量呈逐漸上升后下降的趨勢。圖4(B)中，含水量和尿素添加量的增加，木聚糖含量也逐漸上升。表4中，二次項A2、C2對木聚糖含量均有顯著影響(P<0.05)，進一步說明各因素對木聚糖含量的影響不是簡單地線性關系。

圖4 各因素之間的交互作用影響Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the content of xylan

2.5.3 優化培養基組成的驗證

用 Design-expert 8.0 軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得出的最優培養基組成為含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，在該條換下玉米芯木聚糖含量為69.337 mg/g，在此條件下進行5次重復發酵試驗，實際玉米芯木聚糖含量為70.84 mg/g。與理論值偏差2.16%，說明此模型有效且優化結果可靠。該優化結果比未發酵玉米芯木聚糖含量提高249.82%。

2.6 電鏡掃描

玉米芯原料、H2O2預處理玉米芯、微生物發酵+H2O2預處理玉米芯本研究利用掃描電鏡觀察經過一系列處理后玉米芯微觀結構變化。SEM掃描結果如圖5，玉米芯(圖5 a)表面光滑，結構致密，沒有孔洞損傷。玉米芯經過H2O2預處理后，表面出現較多坑洞，結構變得疏松，木質素結構受到一定破壞，木質素與纖維素和半纖維素之間連接的共價鍵發生了斷裂(圖5 b)；玉米芯經過微生物發酵+H2O2預處理后，玉米芯表面孔洞更大更多，結構更疏松(圖5 c)。H2O2預處理后玉米芯較疏松的結構可顯著增加微生物菌體細胞及其產生的酶與玉米芯表面的接觸，提高微生物對玉米芯中木質纖維素的降解效率[13],促進木聚糖的釋放。

圖5 預處理前后玉米芯的掃描電鏡圖(100×，20×)Fig.5 SEM of corncob before and after pre-treatment(100×，20×)

3 結論

玉米芯內部結構復雜，而木質素又緊密包裹在纖維素和半纖維素周圍，形成天然抗降解屏障，保護纖維素和半纖維素不受微生物的破壞[14]。因此，去除木質素是解除玉米芯天然抗降解屏障、提高微生物發酵效率的首要任務。預處理可以增加底物的多孔性，進而增加可及性，顯著提高微生物發酵效率[15]。H2O2作為去除木質素的去除試劑，玉米芯的細胞壁結構被H2O2氧化后，細胞壁外面包圍的木質素被軟化，半纖維素和纖維素與木質素之間的氫鍵發生斷裂，微生物可更好的利用纖維素和半纖維素從而提高發酵效率，釋放更多木聚糖[14-16]。本實驗中玉米芯經H2O2預處理后再發酵，其發酵產物中木聚糖含量52.72 mg/g，較未經H2O2預處理玉米芯發酵產物中木聚糖含量提高了186.76%。

將H2O2預處理玉米芯作為培養基，利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合固態發酵，其產物中木聚糖含量可達70.84 mg/g，較H2O2預處理玉米芯中木聚糖含量提高了60.01%(44.27 mg/g)，由此可見微生物發酵可顯著提高玉米芯木聚糖含量。這可能是由于釀酒酵母屬于真菌，真菌降解纖維素的主要機制是分泌大量的胞外酶來破壞木質纖維素的緊密結構，從而有效降解玉米芯。枯草芽孢桿菌屬于細菌，細菌降解木質纖維素的機制是主要通過分泌的纖維素酶的纖維素結合域附著在木質纖維素的表面，纖維素受細菌作用易于膨脹而被破壞分解[17，18]，從而促進玉米芯木聚糖的釋放。

通過H2O2預處理能夠提高微生物發酵效率，提高玉米芯木聚糖釋放，其結構的變化是玉米芯木聚糖含量提高的內在原因。SEM圖像表明，玉米芯纖維素、木質素相互纏繞的致密結構及其表層均被H2O2破壞，更容易被微生物利用，從而經微生物發酵后的玉米芯表面孔洞更大更多，結構變得更疏松。本實驗采用微生物發酵結合H2O2預處理提取玉米芯中木聚糖，其最佳工藝為：4%H2O2預處理玉米芯原料1 h后，采用釀酒酵母：枯草芽孢桿菌9∶1比例發酵，發酵培養基組成為含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，該條件下玉米芯木聚糖含量可達70.84 mg/g。