巴戟天寡糖提純工藝及藥理作用研究進展

李鑫潔，李玲玲，魯 藝

北京中醫藥大學 中醫學院，北京 100029

巴戟天為茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根，在《神農本草經》中被列為上品，和益智仁、砂仁、檳榔統稱為著名的“四大南藥”。巴戟天可補腎陽、祛風濕、強筋骨，在古代臨床運用于陽痿遺精，宮冷不孕，月經不調，少腹冷痛，風濕痹痛，筋骨痿軟[1]。現代化學研究表明，巴戟天中含有環烯醚萜類、無機酸類、糖類、蒽醌類等活性成分，臨床運用于抑郁、甲狀腺功能異常、記憶力減退、生殖損傷、骨質疏松等癥[2-6]。

巴戟天中含糖量較高，包括單糖、寡糖和多糖，其中寡糖也稱菊淀粉型低聚糖，有一定的細胞識別與防御功能[7]，具有一定研究和開發價值。研究表明[8-12]，巴戟天寡糖具有抗應激、抗抑郁、 促進精子生成、清除活性氧、抗心肌缺血再灌注等作用。然而，寡糖分子含有大量羥基，化學性質相似，且自身存在多分支、多種連接方式、衍生化、多樣立體化等復雜特點，使得寡糖混合物的分離與檢測成為一大難點。因此，優化提取分離巴戟天寡糖成分工藝成為當下研究界的熱點。本研究歸納總結近年來關于寡糖分離純化文獻中的方法，為尋求新型有效、高效快速的巴戟天寡糖分離方法奠定基礎，為從巴戟天寡糖角度探索其抗抑郁機制提供選擇。

1 寡糖提取工藝

提取分離巴戟天寡糖的報道并不很普遍。寡糖常為2～10個單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚糖，多羥基，具有一定程度的親水性，以乙醇回流最常用，但存在溶媒介質影響等不確定因素，導致提取物含量降低，影響臨床療效等；此外，還可以用超聲波提取、微波提取、生物提取等現代提取方法[13,14]，也可以利用生化科技及酵素反應，以淀粉及雙糖(如蔗糖等)合成寡糖，其中超聲提取法已成為許多中藥成分分析過程中的重要手段。

周奮進等[15]以95%乙醇溶液為提取液，液料比為8∶1，加熱回流提取3次，每次30 min，最終得到桂花寡糖提取率為90.29%，明顯比水提取桂花寡糖提取率高。信維平[16]用乙醇-甲醇和乙醇兩種溶劑提取，觀察其對提取率的影響，確定最佳提取條件，苯酚-硫酸法測得寡糖提取率達到3.6%。實驗中常用寡糖提取方法為水提醇沉法，用80%乙醇提取使多糖沉淀，以減少多糖的干擾，有利于下一步純化。

微波提取是利用微波來提高萃取率的新技術，微波輔助提取的研究表明[17]，微波輻射誘導萃取技術在提取過程中藥材不凝聚、不糊化，克服了熱水提取易凝聚、易糊化的特點。王章存等[18]通過500W的微波不僅顯著提高了大豆寡糖含量，且更易脫鹽。邵錦挺[14]用類芽抱桿菌WL菌株進行瓊膠酶發酵，確定瓊膠酶降解瓊膠得到寡糖的最佳工藝。提取方法比較見表1。

表1 天然寡糖提取方法比較

2 寡糖分離純化工藝

寡糖的提取液常常伴隨著其他化學物質或副產物存在，因此，寡糖的分離純化工藝是獲取寡糖單體的關鍵步驟，目前，寡糖的分離方法有層析法、親水作用液相色譜法、電泳法等[19-22]。

2.1 活性炭柱層析法

色譜法利用組分在固定相和流動相中平衡分配系數不同而使各成分分離開，適用于糖類分離的色譜填充材料有：活性炭、鋁礬土、石英砂、離子交換樹脂等。

活性炭是一種非極性吸附劑，對中藥中某些苷類、糖類及氨基酸等具有一定分離效果，適于工廠大量制備型分離。馮峰等[23]運用活性炭，硅膠等色譜及波譜法，從巴戟天屬中分離鑒定6個寡糖類化合物，分別為：耐斯糖 、1F-果呋喃糖基耐斯糖、蔗糖、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖 、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖 、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖，后三個化合物首次從巴戟天屬中分離得到。

此外，邱建國等[24]分別以活性炭及陽離子-陰離子樹脂-活性炭聯用兩種方法以分離地黃寡糖部分，表明單用活性炭時，甘露三醇為15%乙醇洗脫物中的主要成分；陽離子交換樹脂-陰離子交換樹脂-活性炭聯用時，水蘇糖(天然四糖)為10%乙醇脫物中的主要成分。

張安強等[25]先利用水提醇沉法，除去猴頭菌子實體中的雜質多糖得粗寡糖，再經陰離子交換(DEAE-Sepharose FF)和丙烯酰胺凝膠進行分離，得到鹽性寡糖HEOF-0.1，水溶性寡糖HEOF-W-B(由3個阿拉伯糖組成)及單糖HEOF-W-C。但此法耗時長、分離效果不很明顯。

2.2 多孔石墨化碳液相色譜法(PGC)

多孔石墨化碳液相色譜固定相為多孔石墨化碳填料，流動相可以為水、甲醇或乙腈。 Lívia Budai等[26]通過用PGC色譜與質譜聯用技術對AGP進行了分離及樣本分析，得到18種分子量不同的低聚糖，并且這些低聚糖的同分異構體也被分離出，證明天然寡糖異構體在PGC柱上分離良好，同時補充了傳統質譜的不足之處。

Westphal等[27]研究了不同PH在PGC上保留行為，結果顯示，中性寡糖β-(1,4)-葡寡糖和β-(1,4)-木寡糖的比α位的寡糖保留時間更長，表明寡糖的結構越接近平面，與PGC結合位點越多，保留時間越長；同時，酸性寡糖α-(1,4)-半乳糖醛酸寡糖與其甲基化做對比，發現甲基化后的保留時間明顯減少，證明離子強度在PGC中的影響。

2.3 高效陰離子交換色譜法(HPAEC)

高效陰離子交換色譜一般與脈沖安培檢測器(PAD)聯用，其固定相為陰離子交換樹脂，是寡糖分離與檢測的有效手段。仰鐵錘等[8]采用HPAEC-PAD技術，以耐斯糖 、1F-果呋喃糖基耐斯糖、蔗果三糖作為指標，對巴戟天寡糖類成分進行分離檢測，并確定以Hemilton RCX-10陰離子交換樹脂為色譜柱、流速0.8 mL/min、柱溫30 ℃為最佳色譜條件。同時發現鹽制巴戟天的含糖量相對較高，而巴戟天莖葉中幾乎不含糖。

2.4 高速逆流色譜法(HSCCC)

高速逆流色譜法是一種連續高效液-液色譜分離技術，能基本回收全部樣本，很適合天然產物活性成分的分離。HSCCC與傳統色譜法相比[28,29]，具有樣品無損失、無污染等優點，被廣泛應用于成分分離、生物化學、化妝品等領域，在天然產物領域中已被認為是一種有效的新型分離技術。步知思[30]利用大孔樹脂-高速逆流色譜聯用分離純化地黃中毛蕊花糖苷，發現通過大孔樹脂-高速逆流色譜聯用，并以乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5)組成的兩相溶劑體系進行洗脫，麥角甾苷的純度高達96%。

2.5 毛細管電泳法(CE)

絕大多數糖類化合物極性較大，大都不帶電荷，一般無法用毛細管電泳法。然而，可使糖類化合物衍生化的方法使之帶上電荷或熒光基團得以分離[31]。由于毛細管內徑的限制，檢測信號是CE系統最突出的問題。紫外可見法(UV)是CE常用的檢測方法，但是受到儀器、單波長等因素的限制。目前應用最廣泛的是二極管陣列檢測器(PDA)。常規的檢測器還有靈敏度很高的激光光熱(LIP)和熒光(FL)檢測器。MAOW等[32]采用CE耦合激光誘導熒光分離檢測了肝素與寡糖。

2.6 中壓液相色譜聯用技術

中壓液相色譜聯用技術屬于快速色譜法之一。研究表明[33,34]，通過與折射率檢測器(RID)的耦合，快速色譜可以進一步用于分離植物功能性低分子量碳水化合物。

Xu L[35]等利用中壓液相色譜耦合蒸發光散射檢測器(ELSD)和二極管陣列檢測器(PDA)，以氨丙基鍵合硅膠為色譜柱的填充材料，從蓮子中分離制備出五種寡糖。此方法無需提取等復雜的前期處理工藝，同時也減弱了極性化合物的過度吸附，為從天然藥用植物中大量獲取高純度低聚糖的制備提供了新的思路和方法。

2.7 親水作用液相色譜技術(HILIC)

親水作用液相色譜也稱為“反反相”色譜。華東科技大學[36]利用親水作用液相色譜技術分離靈芝中的棉子糖家族寡糖，分離得到水蘇糖、毛蕊花糖和棉子糖。表明通過親水相互作用液相色譜分離、純化和定量寡糖是有可能的。Xingchen Zhai等[37]研制了一種基于硅膠的3-氨基苯硼酸親水作用液相色譜固定相，通過調整流動相中水分的比例，設計描述吸附和表面吸附的模型，用堿基和核苷來評價保留特性，并探討保留機理，在殼寡糖分離中表現出了良好的分離效果，并優化了色譜柱條件，得到較好的指紋圖譜。結果表明，該保留機理是分配作用和表面吸附作用相結合的結果，而氫鍵似乎是影響保留行為的主要因素。

2.8 膜分離技術

膜分離技術一般分為微濾、超濾和納濾3種類型。可以選用超濾法除去蛋白質等大分子物質，同時利用納濾膜除去半乳糖等小分子糖類，從而獲得高純度的功能寡糖混合物。Karina Altmann等[38]在分離牛乳寡糖中發現，300 Da的納濾膜可以有效除去小分子物質，從而使獲得的寡糖的含量比原來高100倍。但是想要分離大小相近的寡糖單體，還需多孔濾膜技術的進一步發展。分離方法比較見表2。

表2 天然寡糖分離方法比較

續表2(Continued Tab.2)

方法Method機理Mechanisation適用范圍Scope of application 優點Merits缺點Drawbacks常用檢測器Common detector實例Example膜分離技術Membrane separa-tion technique分子量大小 Molecular weight不同分子量寡糖Different molecu-lar weight oligo-saccharides獲得不同分子量段寡糖、操作簡單Oligosaccharides with different mo-lecular weights were obtained and the operation was simple膜孔選擇困難、易堵塞、不易區分分子量相近寡糖 The membrane pore is difficult to select, easy to block and difficult to distinguish oli-gosaccharides with similar mo-lecular weight質譜Mass spectrum牛乳寡糖Milk oligosaccha-rides

3 寡糖成分檢測方法

巴戟天寡糖成分是巴戟天藥材發揮其生理作用的主要生物活性成分，其成分的結構分析和含量測定的準確分析能更好的對巴戟天及其相關藥材進行質量評價，同時對其藥動學和藥效學的研究都有很大的影響。基礎的檢測方法一般有甲基化分析、Smith降解、核磁共振波譜 (1H,13C NMR)、快原子轟擊質譜 (FA-BMS) 等方法，其中的物理方法大多都以聯用的形式，使分析更簡便、準確、高效。

3.1 化學衍生化法

由于巴戟天低聚糖類成分在紫外-可見光范圍內無吸收峰及熒光，因此通常采用衍生化后再測定紫外吸收的方法進行檢測或直接采用薄層色譜法進行檢測。林芳花等[39]用鹽酸先使巴戟天寡糖成分水解為果糖，再生成羥甲基糠醛，采用紫外-可見分光光度法，在280 nm處測得不同批次巴戟天藥材中低聚糖質量分數在 34.27%～40.48%。但此方法破壞原寡糖成分結構，不適于寡糖成分結構解析，且對鹽酸的濃度、量、溫度等條件要求較高。

3.2 聯用法

郝慶秀等[22]利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜 (UPLC-Q-TOF-MS～E) 的方法，對巴戟天低聚糖成分進行在線快速分析鑒定。以水-乙腈為流動相，梯度洗脫，ESI 正、負離子模式下采集數據，根據其精確相對分子質量、質譜裂解碎片、色譜保留時間、以及已知同類化合物的碎片特征，對未知成分進行結構推測。該實驗鑒定了19個巴戟天低聚糖成分，為巴戟天藥材的創新性開發利用研究提供了科學依據。

鄧少東等[40]利用親水作用色譜-蒸發光散射檢測器聯用法同時測定巴戟天中蔗糖，蔗果三糖，耐斯糖，1F-果呋喃糖基耐斯糖，巴戟甲素這5種低 聚 糖 的 含 量，采 用 Waters XBridgeTMAmide(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm) 親水性作用色譜柱，以乙腈(A)-0.2% 三乙胺溶液(B) 為流動相，梯度洗脫，流速 0.8 mL/min，柱溫 40 ℃，以 ELSD 檢測，結果顯示 5 種低聚糖線性關系良好，并測定了 13 批次的藥材，各組分質量分數均在 0.57%～10.1%。

梁達清等[41]利用HPLC/ESI-MS法檢測10批來源地不同的巴戟天寡糖成分，分析發現不同產地、不同炮制方法對寡糖成分含量均有影響，其中含量最高達18.90%，含量最低至2.72%。此外，此實驗首次在巴戟天寡糖中發現了二聚糖和三聚糖，為巴戟天藥材的研究和開發提供了依據。

液質聯用法不僅可以測定巴戟天成分含量，評價巴戟天質量，還能對不同品種巴戟天進行差別鑒定，丁平等[42]利用HPLC電化學法對巴戟天低聚糖類成分的指紋圖分析，可用于鑒別巴戟天及其常見混偽品。

4 寡糖成分藥理作用

現代研究表明巴戟天在神經系統、免疫系統、內分泌系統及心血管系統都有貢獻，其中巴戟天寡糖成分在神經系統中的貢獻尤為突出[43-45]，且與傳統功效相對應，是目前科研者們所關心的熱點之一。

4.1 抗抑郁

崔承彬等[46]等首次從巴戟天中提取出寡糖成分，分離出的寡糖類成分能在不影響小鼠自發活動的劑量下，顯著縮短小鼠懸尾實驗的不動時間，初步判定巴戟天寡糖具有一定的抗抑郁作用，這為學者研究抗抑郁藥物打開了新世界的大門。

徐德峰等[9]應用慢性不可預見應激法，建立雄性SD大鼠抑郁模型，以巴戟天寡糖和氟西汀作對照品，通過糖水偏愛測試和強迫游泳實驗觀察大鼠行為變化，發現巴戟天寡糖能增強大鼠對糖水的偏愛，并顯著減少大鼠強迫游泳不動時間，表明巴戟天寡糖具有抗抑郁作用。同時，用蛋白免疫印跡法檢測后，發現巴戟天寡糖高劑量組能顯著增加模型大鼠海馬區BDNF、Synapsin1的表達，推測其作用機制可能是調節腦源性神經營養因子通路及突觸可塑性。

根據《生命科學周刊》新聞作者關于北京大學的研究報道[47]，實驗先以大鼠蔗糖偏好實驗和強迫游泳實驗證明巴戟天寡糖能有效改善慢性應激引起的抑郁樣行為。再以LY294002(PI3K抑制劑)為抑制劑注射于內側前額葉皮層，用Western blot法檢測磷酸化Ser9-糖原合成激酶3β-連環蛋白、BDNF及突觸蛋白在內側前額皮層和眶額皮質的表達。依舊通過觀察強迫游泳實驗發現巴戟天寡糖抗抑郁作用不明顯，表明巴戟天寡糖抗抑郁作用機制可能與位于內側前額葉皮層的BDNF-GSK-3β-連環蛋白有關。

陳云志等[48]通過文獻分析，認為巴戟天寡糖抗抑郁作用可能與維生素D缺乏影響維生素D軸有關。研究表明[49,50]，給抑郁模型小鼠單用維生素D或維生素D聯用丙咪嗪后，小鼠腦組織的BDNF表達顯著提高；維生素D也干預抑郁小鼠腦中5-HT及多巴胺(DA)的表達。因此，巴戟天寡糖可能通過維生素D發揮抗抑郁作用。

此外，Qiu ZK等[5]使用連續單一應激組(SPS)模型進行評估，結果顯示巴戟天菊糖型寡糖可逆轉SPS處理大鼠的行為缺陷，即減少情境恐懼范式中凍結時間，同時又不影響其開放領域正常活動，其還能增加前額葉皮質、海馬及杏仁核中別孕烷醇酮含量，表明巴戟天菊糖型寡糖的抗創傷后應激障礙(PTSD)與別孕烯醇酮合成有關。

4.2 增強記憶力與抗衰老

陳地林等[43]采用SD大鼠雙側海馬區注射 Aβ25-35各10 μg制備擬癡呆模型，以安理申(0.125 mg/kg/d)為陽性藥組，結果顯示與模型組比較，各給藥組大腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活力均增加，MDA含量降低(P<0.01)。此外，各給藥組乙酰膽堿水平升高，乙酰膽堿酯酶水平降低且腦能量代謝水平Na +/K+-ATPase活性升高。提示巴戟天寡糖可通過提高抗氧化能力、激活腦能量代謝、改善膽堿能系統損傷等作用以改善Aβ25-35致大鼠癡呆癥狀。同時，水迷宮測試結果顯示，模型組定位航行潛伏期明顯長于空白組，其定位航行總路程明顯高于空白組，而各給藥組潛伏期明顯縮短。推測巴戟天寡糖可以明顯提高Aβ25-35致擬癡呆大鼠學習記憶能力。

4.3 改善生殖功能

丁平等[12]采用以環磷酰胺(CTX)損傷引起雄性小鼠精子減少的模型，以甲睪酮組為陽性藥組，巴戟天水提液組、巴戟天80%乙醇提取液組及巴戟天寡糖結晶組分別為給藥對照組進行實驗，給藥完畢后檢測精子數、精子活動率及精子畸形率，發現與空白組比，模型組小鼠精子數降低25.8%(P<0.05)，精子總活動率降低33.7%(P<0.01)，提示造模成功。三種給藥組與模型組相比，精子數及活動率均升高，其強弱順序為巴戟天結晶、巴戟天80%乙醇提取液、巴戟天水提液，推測巴戟天寡糖可能為促進精子生成的基礎物質。同時，三組給藥組與模型組相比，精子畸形率無顯著差異，可初步判定巴戟天寡糖提取物無毒副作用。

趙君等[51]采用“勞倦過度，房事不節”方法建立陽虛小鼠模型，給藥6周后，發現高劑量治療后FSH、LH、T、GnRH均明顯升高(P<0.01)，推測巴戟天寡糖可能是通過調節垂體-下丘腦-性腺軸而改善生殖功能。

4.4 抗炎

程亮星等[52]以大鼠子宮缺血再灌注損傷為炎癥模型，巴戟天寡糖液給藥，以酶聯免疫吸附測定法檢測。結果顯示，3組梯度給藥組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均降低，且有統計學差異(P<0.05)，給藥組各兩組之間也均有統計學差異(P<0.05)。提示巴戟天寡糖能夠減輕子宮缺血再灌注損傷后的炎癥反應，可保護子宮，減少其缺血再灌注的損傷。

4.5 促進血管生成

馮國清等[53]在采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型及大鼠急性心肌梗死(AMI)模型，麝香保心丸為陽性藥的實驗中發現，巴戟天寡糖含藥血清組和堿性成纖維細胞生長因字(bFGF)組中小血管以載體為中心呈輻射狀生長顯著，且與AMI模型組相比，巴戟天寡糖中、大劑量組能顯著增加微血管密度(MVD)及血管內皮生長因子(VEGF)、bFGF光密度值，但作用弱于麝香保心丸組。提示巴戟天寡糖不僅可以促進CAM的血管生成，還可促進AMI后大鼠缺血心肌的血管生成，改善缺血心肌局部的側支循環，其機制可能與調節AMI后缺血心肌VEGF、bFGF蛋白的表達有關。楊景柯等[54]也通過實驗證明了巴戟天寡糖可促進CAM血管生成。

5 總結與展望

近些年抑郁癥患者人數增長比率較大，越來越年輕化，研究發現抑郁癥不僅和心理因素、壓力過大有關，還與腦區前額葉和邊緣系統的特異性異常、神經通路受損、單胺代謝、腦源性神經營養因子(BDNF)、下丘腦-垂體-腎上腺軸和去甲腎上腺素功能障礙及分子水平有關，但發病機理仍不很明確，大多機理證明只是初步確定，其發病機制是否是通路受損，代謝異常等復合作用的結果，還需進一步研究證實。

在臨床上，劉飛虎等[55]對 42 例腎虛型抑郁癥患者進行巴戟天寡糖膠囊抗抑郁臨床觀察，發現巴戟天寡糖膠囊對輕、中度抑郁癥有較好的療效。孔慶梅等[56]自2007年3月至2008年1月采用隨機、雙盲雙模擬、安慰劑對照等研究方法，對巴戟天寡糖膠囊在臨床上治療抑郁癥的安全性和有效性作評價。中醫腎虛證量表結果顯示，巴戟天寡糖膠囊有效率高于對照組，且在治療劑量下，巴戟天寡糖膠囊的不良反應比對照物鹽酸氟西汀輕，安全性好，為巴戟天寡糖膠囊推廣至臨床治療抑郁癥提供依據。

高純度巴戟天寡糖成分能為更好的深入研究巴戟天寡糖抗抑郁作用機制打下基礎，HPAEC、HILIC等現代技術逐漸發展起來，既保留了傳統分離技術的優點又改善其不足之處，但仍存在對于化學成分相似的物質無法精分且檢測困難這幾大難題，除了對工藝條件的優化，采取各種聯用技術等方法，還需探索更多有益、綠色、高效的分離純化方法，以便優化巴戟天藥材低聚糖的分離、分析和鑒定條件，為探究寡糖藥理機制奠定基礎，發揮巴戟天的最大利用價值。