豬瘟、豬藍耳病、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌多重混合感染的診斷

梁海英，張愛瓊，曾智勇，王 彬，徐 國，咸 文，何小莉，陳 娟，吳好葉

（貴州大學，貴州 貴陽 550025）

豬瘟（CSF）是由于豬只感染豬瘟病毒（CSFV）后所引起的一種具有傳染性的疾病。該病高度接觸性傳染，短時間內急性發病可導致豬只死亡，臨床感染表現為持續性高熱、全身性點狀出血、脾臟出現梗死阻塞，通常又稱為 爛腸瘟”。因其對養豬業的發展造成巨大的危害，在我國將其列為一類傳染病[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)一種以損害母豬繁殖系統以及豬只呼吸系統疾病的病毒性傳染病，因感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV）而引起，通常稱為 豬藍耳病”。懷孕母豬感染 PRRSV后會出現流產現象，后期產出胎兒死亡、孱弱以及呈木乃伊樣等；PRRSV對保育豬的感染率和死淘率較妊娠母豬高，導致豬只生長發育性能很大程度上降低，臨床上豬只大多表現為呼吸不暢、食欲不佳、持續高熱不下、精神萎靡，感染高致病性豬藍耳病的豬只發病率和死亡率均較高[2]。副豬嗜血桿菌病（HSP）是豬只感染副豬嗜血桿菌所引起，具有傳染性，臨床上常出現關節炎、腦膜炎和漿膜炎等癥狀又稱革拉氏病，其對保育階段的豬只造成的威脅最大，常與其他病毒或細菌以混合感染的形式存在[3]。豬鏈球菌病是一種發病急、傳染性高的人畜共患病，因接觸致病性豬鏈球菌而導致感染[4]。

2018年7月，貴州某養殖場育肥豬在隔離免疫期間發病，出現高熱稽留、喘氣、呼吸困難、食欲不振等癥狀，豬場使用多種抗生素，未見有明顯效果，先后死亡400余頭，導致豬場損失慘重。為確診育肥豬發病死亡病因，故將2頭癥狀較為典型的發病豬送檢，現將檢測診斷結果報告如下，以供參考。

1 臨床及發病特征

據述，2018年7月，貴州某養殖場從貴州多個地方收購育肥仔豬800余頭，在隔離期間免疫豬瘟疫苗后豬只相繼出現病癥，臨床上表現為高燒不退、飲食不佳、精神萎靡、呼吸急促，采用多種抗生素藥物治療未見有效，發病期間豬只先后死亡400余頭；送檢豬只體表污穢，極度消瘦。

2 病理解剖特征

將2頭極度消瘦的送檢病豬進行剖檢觀察，可見其中1頭育肥豬胸腔積液呈典型 絨毛心”、肺臟與胸腔粘連，腹腔臟器表面有纖維素性滲出物（圖1）；另1頭脾臟嚴重腫大，肺炎病癥明顯，在肺門、腹股溝等處的淋巴結有嚴重的腫大出血現象（圖2，3）；2頭病豬腎臟均有散在出血點（圖4）。

3 病毒學和細菌學診斷檢測

通過對送檢豬的臨床發病特性和病理剖檢觀察結果，初步確定送檢病豬可能存在細菌和病毒混合感染。根據送樣要求，對病豬組織樣品進行CSFV和PRRSV的RT-PCR檢測，同時對豬圓環病毒病和豬偽狂犬病2種病毒進行檢測，以及細菌檢測。

圖1 腹腔臟器表面有纖維素性滲出物

3.1 病毒檢測

根據實驗需求，適量采集2頭送檢病豬內臟組織（脾、肺、淋巴結等）合在一起，勻漿反復凍融3次后13 000 r/min離心7 min，取上清， 應用 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 核酸提取試劑盒提取核酸，分別對 CSFV、PRRSV、 PRV 和 PCV2 進行檢測。RT-PCR 反應體系（25.0 μL）：2 倍一步法的 Buffer 12.5 μL， 核酸模板 4.5μL， 引物 F/R 各 0.5μL， 一步法的酶 1.0 μL，RNase Free ddH2O 6.0 μL，反應條件為50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，37個循環；72℃ 10 min。PCR反應體系為（25.0 μL）：2hTaq酶 12.5 μL，ddH2O 6.0 μL， 引 物R/F各1.0 μL，核酸模板4.5 μL。PRV反 應 條 件 為：94℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 個循環；72 ℃ 10 min。PCR 反應結束后，將獲得的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并拍照記錄。結果顯示，CSFV和PRRSV均呈陽性，PCV2和PRV均呈陰性（如圖5）。

圖2 腹股溝等處的淋巴結嚴重的腫大出血

圖3 肺門淋巴結腫大出血

3.2 細菌檢測

圖4 病豬腎臟出現散在出血點

圖5 病毒PCR檢測結果

無菌剪取少量的病豬新鮮肺臟、脾臟分別于胰酪大豆胨（TSB）液體培養基（含5%的胎牛血清）中培養12 h后，分別取新鮮培養的脾臟和肺臟菌液進行革蘭氏染色。在顯微鏡下觀察，結果發現在腫大的脾臟培養物中有鏈球菌（圖6 A）和肺臟培養物中疑似副豬嗜血桿菌樣的革蘭氏陰性小桿菌（圖6 B）。

為確定該革蘭氏陰性菌是否為副豬嗜血桿菌，將培養的菌液離心，用 PBS清洗處理2次，使用生工生物公司細菌 DNA提取試劑盒根據革蘭氏陰性菌提取方法提取細菌 DNA，反應體系為（25.0 μL）：金盾Mix 21.0 μL，引物R/F各1.0 μL，DNA核酸模板2.0 μL。副豬嗜血桿菌PCR反應程序為：94℃ 5 min ；94 ℃ 50 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，36 個循環；72 ℃ 10 min。將反應后獲得的產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。檢測結果顯示，副豬嗜血桿菌病為陽性（如圖7）。

4 討論

根據PCR/RT-PCR檢測，可以確診該送檢發病豬除感染有PRRSV外，CSFV也呈陽性，據述該豬群近期先后做了2次豬瘟疫苗免疫，因此該CSFV系疫苗毒的可能性較大。結合病理剖檢和檢測結果，病豬發病與PRRSV相關性較大，PRRSV為免疫抑制性病原，豬只感染后免疫調節受到抑制，導致機體對其他病原體的抵抗力降低，自身免疫調節能力極度下滑，繼而出現多種病毒或細菌的混合感染情況。根據發病豬解剖病癥以及細菌的初步染色鏡檢結果可知，發病豬同時還存在副豬嗜血桿菌和鏈球菌的感染。副豬嗜血桿菌病主要導致肺臟、胸腔和關節漿膜出現纖維素性炎癥，臨床特征為咳喘、呼吸不暢、體態消瘦、皮毛粗亂[5]，在養豬業飼養管理過程如CSFV和PRRSV等病毒感染或是飼養管理不當等因素均可誘發該病的發生。豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病是現代規模化養殖中常見的兩種細菌性傳染病，通過呼吸與排泄物感染各個階段的豬只，鏈球菌病最早發生在仔豬10日齡左右，而副豬嗜血桿菌病在仔豬斷奶后逐漸顯現，兩者相互促進使其對豬只的危害加深[6]。

對于該豬場CSFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌多病原感染的情況，應制定科學的免疫程序，對豬只進行豬瘟兔化弱毒疫苗和PRRSV疫苗的免疫接種，并且對 CSFV和 PRRSV的抗體進行定期監測，嚴格控制病毒的感染及蔓延，以降低危害，對于豬瘟感染的情況可用豬瘟血清抗體，硫酸慶大霉素進行肌肉注射或靜射，1次/d，持續3 d，對于重癥豬，要及時治療[7]。PRRS和 CSF目前尚無特治療效藥，但可以通過疫苗接種進行預防，以減少其帶來的危害，在飼料中添加適當的抗菌藥物以防止豬群的繼發性感染，在哺乳仔豬在斷奶前后，可飼料中添加適量的黃芪多糖和抗生素，以提高豬只自身免疫力和抵抗力，以預防豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征繼發的細菌性感染。預防副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌的感染，應適當降低飼養密度、減少溫度差異等環境可能帶來的應激因素，注重藥物保健，在飼料中添加適量的抗菌藥物[8]，同時要強化飼養管理，尤其是圈舍要經常性消毒，保持通風和環境干燥，在購進豬只隔離期間，消毒工作不能懈怠，在飲水中可適量添加電解多維，飼料中可添加氟苯尼考或替米考星等藥物進行保健7 d以上，并及時監測豬群疫苗免疫水平，適時做好相關疫苗的有效免疫。

圖6 細菌革蘭氏染色結果

圖7 細菌PCR檢測結果