沉默氧增強蛋白(OEE2)對辣椒疫霉效應因子RxLR19781的免疫功能影響

梁濤,王儷穎,朱彤彤,馬艷飛,江韋霖,冀瑞卿*

沉默氧增強蛋白(OEE2)對辣椒疫霉效應因子RxLR19781的免疫功能影響

梁濤1,王儷穎1,朱彤彤2,馬艷飛2,江韋霖2,冀瑞卿1*

1. 吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心, 吉林 長春 130118 2. 山東農業大學植物保護學院 山東省蔬菜病蟲生物學省級重點實驗室, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌()是一種寄生范圍廣且能夠產生大量RxLR效應因子來參與侵染寄主的病原卵菌。資料表明目前對多數辣椒疫霉RxLR效應因子在植物體內如何行使功能積累較少。本研究從辣椒疫霉菌中分離鑒定1個效應分子RxLR19781，為了初步明確RxLR19781的功能特性，本研究借助于煙草脆裂病毒（，TRV）介導的基因沉默技術，將RxLR19781的互作蛋白基因NbOEE2在本氏煙中瞬時沉默，通過qRT-PCR驗證得到NbOEE2沉默植株，在沉默后的本氏煙植株中接種RxLR19781并驗證該RxLR效應因子的功能。結果表明，在NbOEE2沉默植株上，RxLR19781不抑制辣椒疫霉游動孢子侵染。本研究結果表明OEE2可有效調控RxLR19781的功能特性，為進一步深入開展辣椒疫霉效應因子RxLR19781功能機制研究奠定了基礎。

辣椒疫霉; 效應因子; TRV; 基因沉默

辣椒疫霉菌（）是一種在世界范圍內廣泛引起辣椒疫病的土壤兼性寄生菌，其分布廣泛，主要寄主是包括辣椒、茄子、西紅柿、黃瓜等在內的多種茄科和葫蘆科植物[1]。辣椒疫霉菌引起的作物疫病是作物生產上的毀滅性病害，造成巨大的經濟損失，同時還能侵染模式植物擬南芥和本氏煙，是卵菌研究的重要模式材料[2]。在辣椒疫霉菌侵染寄主的過程中，病原菌能夠分泌大量的RxLR效應分子來調控寄主的防衛反應以躲避寄主的免疫識別[3,4]。當寄主植物不含有相應的抗病蛋白時，效應分子通過干擾或者破壞植物的防衛反應從而促進病原菌的侵染；當寄主植物含有效應分子對應的抗病蛋白，寄主植物識別相應的效應分子引發效應分子觸發的免疫反應(Effector-triggered immunity，ETI)，從而抑制病原菌侵染[5]。

病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是一種轉錄后的基因沉默技術，可以利用攜帶靶標基因序列的cDNA片段病毒載體去侵染植株，從而引起植物內源基因的沉默，通過對植株表型變化的分析，為進一步研究該內源基因的功能提供依據[6]。基于一種雙鏈RNA病毒——煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）所構建的VIGS載體體系，是目前應用最為廣泛的VIGS載體系統。TRV介導的基因沉默(TRV-VIGS)是把TRV病毒的基因組構建到植物表達載體，同時借助農桿菌可以侵染植株的特性，通過農桿菌注射植株將農桿菌侵入到植物中，完成基因轉化[7]。TRV-VIGS以其沉默效率高、持續時間長，寄主植物病毒癥狀輕，不會掩蓋沉默表型，且在各種組織均可產生基因沉默的優點，成為目前應用最為廣泛的一類基因沉默體系，已在番茄[8]、煙草[9]、辣椒[10]、擬南芥[11]等植物上成功應用。

之前研究表明，效應因子RxLR19781可以抑制辣椒疫霉游動孢子侵染，且通過酵母雙雜、雙分子熒光、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)技術驗證了該效應因子與氧增強蛋白（OEE2）互作。本研究借助于TRV介導的基因沉默技術，將氧增強蛋白在本氏煙中瞬時沉默，對OEE2是否參與辣椒疫霉效應因子RxLR19781抑制游動孢子侵染的功能進行更深一步的研究。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料與菌株來源

供試植物為本氏煙，于本實驗室保存。溫度22 ℃，濕度70%，16 h光照，8 h黑暗培養。

辣椒疫霉效應因子RxLR19781來源于本實驗室分離保存辣椒疫霉菌株SD33。農桿菌GV3101為本實驗室保存。供試菌株均保存于山東農業大學植物保護學院真菌資源與利用研究室。

1.2 載體與質粒

本研究中所用到的載體包括：植物瞬時表達載體pBIN-GFP由南京農業大學竇道龍老師饋贈。煙草瞬時沉默載體p-TRV1、p-TRV2由清華大學劉玉樂老師饋贈。大腸桿菌感受態細胞Trans5α采購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 本氏煙RNA的提取及cDNA合成

選取3周大小的本氏煙，利用OMEGA植物總RNA提取試劑盒提取本氏煙總RNA，經瓊脂糖核酸電泳檢測，將質量完好的RNA通過諾維贊反轉錄試劑盒HiScriptII Q Select RT SuperMix for qPCR進行反轉錄，得到本氏煙cDNA。

1.4 NbOEE2基因的克隆及沉默載體的構建

通過本氏煙基因組網站http://sefapps02.qut.edu.au/blast/blast_link.cgi查找NbOEE2基因信息，設計引物，以本氏煙cDNA為模板，克隆NbOEE2基因。將NbOEE2基因連接到T3克隆載體上備用。NbOEE2基因全長1673 bp，分別設計位于該基因108~434 bp處和621~956 bp處的327 bp、336 bp核酸片段的引物，并在上下游引物的5’端加入限制性酶切位點Xba I和Sma I，并命名為OEE2-S1-F/R、OEE2-S2-F/R，引物序列分別為，OEE2-S1-F：TCTAGATATATTTATATTTGTATAATATTGGCTATAAATCAGAGA，OEE2-S1-R：CCCGGGACAGAACATGT，OEE2-S2-F：TCTAGAGGCGTTAAGCGGTTC，OEE2-S2-R: CCCGGGGGTGAAAGATCGAG。以NbOEE2-T3質粒為模板，擴增目的基因片段。通過跑膠驗證回收提取目的片段后，用限制性內切酶Xba I和Sma I對帶有限制性酶切位點的目的片段和p-TRV2載體進行雙酶切，37 ℃酶切2 h。酶切回收后，將片段與載體按8:2的比例混合，通過takara的Solution I連接酶進行過夜連接，轉大腸桿菌DH5α感受態，挑斑驗證。測序正確后，得到沉默重組質粒pTRV2-OEE2-S1和pTRV-OEE2-S2。

1.5 本氏煙的沉默與驗證

分別將pTRV1、pTRV2載體與兩個重組質粒pTRV2-OEE2-S1、pTRV-OEE2-S2轉到農桿菌GV3101中。驗證轉化成功后，挑取含pTRV1、pTRV2和兩個重組質粒的農桿菌GV3101的單菌落，接種到含有Rif、Kana 50 μg/μL的LB液體培養基中，放置于28 ℃恒溫搖床，220 r/min，培養12 h。室溫4000 r/min離心5 min收集菌體；棄上清，10 mM MgCl2洗滌菌體3次；加入適量的10 mM MgCl2（含10 mM MES，200 μM As）溶液懸浮菌體，使懸浮液OD600值達到1.0。將pTRV1分別于pTRV2、pTRV2-OEE2-S1、pTRV2-OEE2-S2等比例混合接種三周大小的本氏煙葉片中。10 d后，采集接種植株的部分葉片，提取RNA，反轉錄合成cDNA，并運用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）軟設計NbOEE2特異性引物，以共接種pPRV1、pTRV2空載體植株作為對照，驗證NbOEE2沉默效率。相比于對照，目的基因表達量低于40%即為沉默成功，證明該植株可作為供試植株作為下一步實驗的材料。

1.6 在沉默的本氏煙植株上做游動孢子侵染實驗

將pBIN-GFP空載體質粒和pBIN-19781質粒轉到農桿菌GV3101中，挑斑搖菌并擴大培養。28 ℃恒溫搖床，220 r/min，培養12 h后收集菌體并用10 mM MgCl2洗滌菌體3次，加入適量的10 mM MgCl2（含10 mM MES，200 μM As）溶液懸浮菌體，懸浮液OD600值調至0.3左右。在長滿辣椒疫霉標準菌株LT1534的燕麥培養基平板上，用手術刀切除1 cm2大小的菌塊3~4塊，倒入山泉水清洗板上剩余菌絲，每隔30清洗1次，洗7-8次，14 ℃過夜培養，收集產出的游動孢子懸浮液。

分別在pTRV2空載體植株和pTRV2-OEE2-S1、pTRV2-OEE2-S2沉默植株的葉片上接種pBIN-GFP菌液和pBIN-19781菌液，24 h后采集葉片置于培養皿中，接種10 μL辣椒疫霉游動孢子。將接種后的本氏煙葉片放于25 ℃培養箱。2 d后觀察差異，分別在日光燈、長波紫外燈下拍照，并進行臺盼藍染色、脫色后拍照。

2 結果與分析

2.1 本氏煙總RNA的提取與cDNA的合成

提取的本氏煙總RNA，通過紫外分光光度計檢測分光廣度值，OD260/OD280值處于1.9~2.0之間，說明所提取的總RNA純度較高，較完整，RNA沒有被降解且蛋白組污染程度較低。通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行進一步檢測，總RNA的28S rRNA、18S r RNA兩條帶清晰(圖1)，表明RNA具有較好的完整性未出現降解，且無基因組DNA污染，可以進行下一步反轉錄實驗。

通過反轉錄，將本氏煙總RNA反轉錄為高質量的cDNA，為下一步目的片段的擴增提供了模板。

2.2 在本氏煙中克隆效應因子互作蛋白NbOEE2

以本氏煙的cDNA為模板，對互作蛋白OEE2進行特異性擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，僅在1600bp左右具有單一性條帶，無其他雜帶（圖2）說明引物特異性高。

圖 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測本氏煙總RNA

圖 2 NbOEE2的克隆

圖 3 瓊脂糖凝膠驗證重組質粒

2.3 沉默載體構建

菌液PCR驗證（圖3）分析表明，pTRV2-OEE2-S1、pTRV2-OEE2-S2重組質粒構建成功，送公司測序驗證正確。

2.4 本氏煙的沉默與驗證

通過qRT-PCR驗證表明（圖4），NbOEE2沉默效率達70%左右，已達到沉默標準，可作為沉默植株進行下一步實驗

2.5 辣椒疫霉游動孢子侵染

結果表明，相比于NbOEE2非沉默植株，在NbOEE2非沉默本氏煙植株上，辣椒疫霉效應因子RxLR19781喪失了抑制游動孢子侵染的能力（圖5）

圖 4 qRT-PCR驗證NbOEE2沉默效率

圖 5 在沉默NbOEE2植株中RxLR19781不再抑制辣椒疫霉游動孢子侵染

3 討論

研究表明，辣椒疫霉菌能夠在侵染寄主的過程中外泌效應因子，進入到植物細胞中干擾植物自身的防衛反應促進或抑制自身侵染定殖[12,13]，效應因子通過與宿主靶標蛋白互作，調控植物的信號通路及代謝活動從而實現自己的功能。因此，為了更好的防治由辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病，我們需要對效應分子的互作靶標蛋白蛋白以及效應分子的致病機制進行更加深入的探究。

本研究以本氏煙cDNA為模板，對辣椒疫霉效應因子RxLR19781的互作蛋白NbOEE2進行特異性克隆。找到NbOEE2基因序列中的特異片段，選取300 bp左右，將該特異片段構建到pTRV2沉默載體中，配合pTRV1沉默輔助載體，借助農桿菌侵染系統，對本氏煙進行瞬時沉默，以達到在本氏煙中瞬時沉默NbOEE2的目的。以沉默NbOEE2后的本氏煙為供試植株，驗證辣椒疫霉效應因子RxLR19781對游動孢子侵染的抑制作用。結果證明，在沉默NbOEE2的本氏煙中，效應因子RxLR19781不再抑制辣椒疫霉游動孢子侵染，喪失了其免疫活性。因此，我們推斷效應因子RxLR19781對辣椒疫霉的抑制作用依賴于NbOEE2。這為我們進一步研究效應因子在寄主體內的作用機理、闡明基因功能通路打下堅實基礎，也為研究其他效應因子的作用機理提供了可靠方法。

[1] 付麗.辣椒疫霉(Phytophthora capsica)果膠裂解酶基因克隆及功能研究[D].泰安:山東農業大學,2012:1-2

[2] 蔣玥.辣椒疫霉中3個RxLR效應子的功能研究[C].中國植物病理學會2017年學術年會論文集,2017:1

[3] Lamour KH, Stam R, Jupe J,. The oomycete broad-host-range pathogen[J].Moleclar Plant Pathology, 2012,13(4):329-337

[4] Yu D, Mpina MH, Birch PRJ,. Phytophthora infestans RxLR effector AVR1 interacts with exocyst component Sec 5 to manipulate plant immunity[J]. Plant Physiology, 2015,169(3):1975-1990

[5] 姜海濱,李京,許海青.辣椒疫霉菌效應因子RxLR23克隆與基因敲除體系建立[J].山東農業大學學報:自然科學 版,2017,48(4):491-496

[6] 宋震,李中安,周常勇.病毒誘導的基因沉默（VIGS）研究進展[J].園藝學報,2014,41(9):1885-1894

[7] Senthil-Kumar M, Mysore KS. Tobacco rattle virus-based virus-induced gene silencing in[J].Nature Protocols, 2014,9(7):1549-1562

[8] Ryu CM, Anand A, Li Kang,. Agrodrench: a novel and effective agroinoculation method for virus-induced gene silencing in roots and diverse[J]. The Plant Journal,2004,40(2):322-331

[9] Senthil-Kumar M, Hema R, Anand A,. A systematic study to determine the extent of gene silencing inand otherwhen heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing [J]. New Phytologist, 2007,176(4):782-791

[10] Czosnek H, Eybishtz A, Sade D,. Discovering host genes involved in the infection by the tomato yellow leaf curl virus complex and in the establishment of resistance to the virus using tobacco rattle virus-based post transcriptional gene silencing[J]. Viruses, 2013,5(3):998-1022

[11] Burch-Smith TM, Schiff M, Liu Yule,. Efficient virus-in-duced gene silencing in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2006,142(1):21-27

[12] Erbs G, Newman MA. The role of lipopolysaccharide and peptidoglycan, two glycosylated bacterial microbe-associated molecular patterns (MAMPs), in plant innate immunity[J]. Molecu Lar Plant Pathology, 2012,13(1):95-104

[13] Dou D, Kale SD, Wang X,. RXLR-mediated entry ofeffector Avr1b into soybean cell doesnot require pathogen-encoded machinery[J]. Plant Cell, 2008,20:1930-1947

Effect of Silencing Oxygen-enhancing Protein (OEE2) on Immune Function of Phytophthora capsici Effect Factor RxLR19781

LIANG Tao1, WANG Li-ying1, ZHU Tong-tong2, MA Yan-fei2, JIANG Wei-lin2, JI Rui-qing1*

1.130118,2.271018,

is a pathogenic oomycetes that has a wide range of parasites and is capable of producing a large number of RxLR effectors to synergistically infect host. The current information indicate that little is known about how theRxLR effector functions in plants. In this study, an effector molecule RxLR19781 was isolated and identified from. In order to preliminarily define the functional properties of RxLR19781, this study used the Tobacco rattle virus (TRV)-mediated gene silencing technology to interact with RxLR19781. The gene NbOEE2 was transiently silenced inNbOEE2 silenced plants were verified by qRT-PCR, and RxLR19781 was inoculated into the silencedplant and the function of the RxLR effector was verified. The results showed that RxLR19781 did not inhibit zoospores infection of Phytophthora capsici on NbOEE2 silenced plants. The results of this study indicate that OEE2 can effectively regulate the functional properties of RxLR19781, which lays a foundation for further research on the functional mechanism of Phytophthora capsici effector RxLR19781.

; effector; TRV; gene silencing

S436.418.1

A

1000-2324(2019)01-0040-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.008

2018-03-12

2018-04-29

國家大宗蔬菜產業技術體系(CARS-25-03B)

梁濤(1993-),男,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學和真菌資源利用. E-mail:664318370@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jiruiqingjrq@126.com