遠隔缺血后適應通過調節反應性星形膠質細胞的可塑性改善小鼠缺血后腦組織的恢復

程 雪，羅玉敏，閔連秋，王 剛

缺血性腦卒中是一系列腦血管疾病導致死亡或嚴重的損傷，正在尋找廣泛的治療措施。其中一個潛在的治療手段就是缺血后適應，它的神經保護被廣泛的證實和認可，是目前發現的強烈的內源性缺血保護措施，缺血后適應是在缺血后給予一個非損傷性缺血適應，使對已嚴重缺血的器官產生保護作用。目前已有研究證實遠隔缺血后適應能對心肌、腎臟、骨豁肌及腦產生缺血保護作用。四肢由于對缺血較耐受，容易觀察缺血的程度，且容易實施缺血適應、具有事后性，目前已成為研究保護器官缺血/再灌注損傷方面的熱點。很多研究表明缺血后適應能抑制缺血再灌注后炎性反應，提高腦循環，減少梗死面積，提高神經再生和血管再生[1]，系統的研究它的臨床應用及神經保護機制加速缺血后適應的臨床轉化[2]。到目前為止，更多的研究集中在腦缺血急性期的神經保護，在缺血性腦卒中恢復期對星形膠質細胞可塑性的研究尚無報道。

腦缺血后星形膠質細胞經歷了快速的增生和肥大，反應性星形膠質細胞形成膠質瘢痕抑制軸索的再生和影響細胞外的微環境[3,4]。根據細胞形態學及解剖學定位，星形膠質細胞被分為兩大主要亞型，原漿型(GS)和纖維型(GFAP)。GFAP是反應性星形細胞的標志， GFAP表達十種不同的亞型，最經典的亞型是GFAPα，在星形膠質細胞的白質和灰質表達，最多的可變剪切是GFAPδ，表達在較低水平， GFAPδ在許多疾病中被誘導變成反應性的星形膠質細胞[5,6]，處理反應性星形膠質細胞亞型和GFAP亞型可提高缺血后神經元的可塑性。

1 材料和方法

1.1 動物和實驗分組 成年雄性C57小鼠，質量22～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號：SCXK(京)2008-0001。于恒溫條件下飼養 (溫度22 ℃～26 ℃，濕度56%～70%，12/12 h日夜循環)。63只小鼠被隨機分為3組：(1)假手術組：小鼠和其他組一樣經過同樣的過程但不插入線栓；(2)模型組：給予大腦中動脈閉塞1 h再灌注；(3)RIPC組：大腦中動脈閉塞后給予RIPC。每組被分為兩個亞組：3 d組(n=12)3只小鼠用于TTC染色，6只用于計算缺血側半球的水腫及蛋白免疫印跡檢測，3只小鼠用于免疫熒光檢測；14 d組(n=9)6只用于計算缺血側半球的萎縮和蛋白免疫印跡，3只用于免疫熒光。如果動物體重不符合需要被排除，所有的研究采用雙盲。

1.2 小鼠模型的建立 建立局灶性腦缺血模型短暫性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。小鼠稱重后采用4%～5%恩氟烷誘導麻醉并用面罩吸入1%～2%恩氟烷混合N2O∶O2(7∶3)維持麻醉。術中通過測量肛溫、心率和平均動脈壓來保持各項生理指標正常。將直徑為0.19 mm線栓(貨號701956PK5Re)緩慢插入至右頸總動脈，缺血1 h后拔出線栓，局灶的腦血流量通過經顱超聲多普勒(PeriFlux System5000；Perimed，Sweden)觀察證實。體溫通過直腸探針檢測，通過加熱毯維持在(37.0±0.5)℃。MCAO再灌注后，小鼠被隨機挑選即刻給予RIPC。為了造成肢體缺血，兩個肢體末端用橡皮帶做成一個小的橡皮管形成一個可逆性的勒除器。用勒除器結扎小鼠雙后肢根部(約股動脈近端1/5～2/5的位置)阻斷雙側股動脈，雙側股動脈被阻斷10 min放開10 min，如此循環3次。在阻斷的過程中，傳感器置于雙側的足背動脈檢測脈沖決定是否肢體的血流被阻斷。如果脈沖消失證明肢體缺血，并且肢體變蒼白。再灌注后，肢體恢復正常的粉紅色。RIPC結束后，小鼠放回籠子里，觀察它們的正常活動，包括行走、進食和睡眠。

1.3 轉棒實驗 小鼠的運動功能在自動化的旋轉棒上被評估。小鼠被放在加速的旋轉棒上(4～40 rpm over 120 s) 并且他們潛在的掉落次數被記錄。在手術前3 d給予同樣的訓練。MCAO后，在3 d、14 d檢測小鼠的情況。每天檢測3次，取掉落的平均值進行統計。

1.4 檢測梗死面積、半球水腫和腦萎縮 神經系統功能評定后，在再灌注3 d、14 d用10%水合氯醛致死劑量腹腔注射處死小鼠，距離大腦前極開始，在腦模具中切出冠狀切片1 mm厚度腦片6片，將腦片放入TTC (TTC；Sigma，USA)溶液中，常溫下20 min后撈出放入多聚甲醛固定液中，正常腦組織呈玫紅色，梗死區腦組織呈白色，拍照。應用Image J軟件分析梗死體積比率。梗死體積的計算根據下面的公式[7]：梗死體積%=[(非缺血側面積總和-非梗死面積)/非缺血側面積總和]×100%。相對腦水腫比率=[(缺血側面積總和-非缺血側面積總和)/非缺血側面積總和]×100%。相對腦萎縮比率=[(非缺血側面積總和-缺血側面積總和)/非缺血側面積總和]×100%[8]。

1.5 Western blot分析蛋白的表達 腦組織在3 d、14 d被收集，缺血側腦組織在緩沖液中處理(RIPA；Cell Signaling Technology，USA)，包括蛋白酶抑制劑(Thermo，USA)和用超聲波細胞粉碎機粉碎組織細胞，在冰上靜置1 h后用12000 g的低溫離心機離心30 min；測蛋白濃度，之后以校正過的BCA標準蛋白吸光值對濃度(μg/ml)做圖繪制標準曲線，使用標準曲線定量計算待測樣品蛋白濃度。在Excel表中算出每100 μl需要加入的 Loading-Buffer的量，統一1 μl內的蛋白質含量。已經加入 Loading-Buffer 的標本-20 ℃冰箱凍存，剩余標本原液-80 ℃冰箱凍存。Western blot的操作按以前的方法[9]，將醋酸纖維素膜浸入配置好的一抗溶液中4 ℃冰箱過夜； GFAP (1∶1000,Santa Cruz)，GS(1∶1000,Abcam)， GFAPa (1∶1000,Santa Cruz)，GFAPδ (1∶1000,Abcam) 和 β-actin (1∶1000,Santa Cruz)。 然后加入二抗(1∶5000,Abgent,USA),通過凝膠成像系統掃描并分析目標條帶的凈光密度值和分子量。用 AlphaEaseFC圖像分析軟件計算出每個條帶MBP及相對應的β-actin灰度值，并用(MBP灰度值)/(β-actin灰度值)計算出相對灰度值，進行統計分析。

1.6 免疫熒光 免疫熒光染色像以前的描述[10]。在再灌注3 d、14 d用10%水合氯醛致死劑量腹腔注射處死小鼠，腦組織冰凍切片復溫后放入4%的多聚甲醛中固定，PBS沖洗后，用含有1%BSA、5%的山羊血清和0.1%的Triton X-100的PBS溶液20 ℃～25 ℃封閉1 h，以阻斷非特異性結合位點。將封閉液洗掉加入按照一定比例稀釋的一抗結合4 ℃孵育過夜。次日，將切片取出，然后加入熒光二抗，然后用防淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡(Olympus,Japan)下找到紅色熒光和綠色熒光并拍照并用FV10-ASW 2.0軟件分析。

2 結 果

2.1 RIPC 降低梗死面積、缺血半球腦水腫和腦萎縮，提高腦缺血小鼠的神經功能及生存率 5種方法測量腦組織的損傷：腦梗死體積、腦水腫、腦萎縮、神經功能評分、生存率。缺血在灌注后缺血半球的梗死體積(見圖1A、B)：缺血在灌注后定量分析顯示缺血半球的梗死體積顯著增加。RIPC治療后顯著降低缺血半球的梗死體積，由模型組的60%降低到40%。腦水腫是另一個常見的方法來評價缺血再灌注腦損傷。我們的數據顯示RIPC能顯著降低缺血再灌注3 d腦組織腫脹(見圖1C、D)。為了研究RIPC在恢復期的保護作用，我們檢測了腦缺血再灌注14 d腦萎縮的情況。我們發現RIPC在14 d能降低腦萎縮的程度(見圖1E、F)。14 d的結果更顯著的表明RIPC在急性期和恢復期對腦缺血再灌注都具有保護作用，為我們進一步研究RIPC的保護作用提供了形態學依據。神經功能評分我們選擇了在缺血后3 d、14 d進行轉棒實驗。相對于MCAO組，RIPC能夠顯著降低缺血后運動功能缺陷，增加轉棒的時間和路程，因此我們推斷RIPC能夠提高缺血后的神經功能(P<0.05，見圖1G)。缺血再灌注后我們還檢測了14 d的生存率，顯示RIPC能提高缺血后的生存率，在MCAO組14 d，我們觀察到幾乎有50%的動物死亡，而RIPC組生存率從55%提高到77%，表明RIPC對腦缺血再灌注有顯著的保護作用(見圖1H)。

2.2 RIPC改變缺血誘導的GFAP和GS的表達 星形膠質細胞可塑性的適應性改變是腦水腫形成的主要原因[11]。星形膠質細胞的畸形生長會形成膠質瘢痕，影響神經修復。結果顯示在3 d缺血后增加的GFAP的表達經過RIPC治療后顯著的降低，這意味著RIPC對GFAP有抑制作用 (見圖2A、B)。 而且，RIPC不影響缺血在灌注后GS的表達(見圖2A、C)。為了研究RIPC能否在恢復期影響反應性星形細胞膠質化，我們檢測了缺血再灌注14 d，GFAP和GS蛋白水平的表達。結果顯示缺血誘導的GFAP的表達經過RIPC治療后沒有顯著的差異。GS的蛋白表達水平經RIPC治療后顯著升高(P<0.05,見圖2D～F)，說明在恢復期RIPC可能通過改變GS的表達發揮作用。同時，我們利用免疫熒光還觀察了在皮質缺血周圍區GFAP的情況。我們觀察到在缺血周邊區有大量增加的GFAP的表達，RIPC治療后GFAP的表達有所減少(見圖2G)。

2.3 RIPC 調節GFAP亞型的比例 星形膠質細胞不同的亞型在神經修復中發揮不同的作用。在正常的中樞神經系統中，GFAPδ∶GFAPα為1∶3是最適合的網絡組成。WB的結果顯示缺血再灌注3 d，小鼠缺血側腦組織GFAPδ 的表達無明顯的改變，而 GFAPα顯著增加，導致 GFAPδ/GFAPα 的比率降低到1∶5；RIPC 治療明顯降低缺血后GFAPα的表達， 同時增加GFAPδ/GFAPα的比率(見圖3A～D,P<0.05)。因此， RIPC 能調節它們的比率達到最佳的網絡組成(見圖3A～D)。然后，我們觀察缺血再灌注14 d后GFAP亞型的變化。WB結果顯示，經RIPC治療后GFAPα 和 GFAPδ 沒有明顯的變化(見圖3E～H)。但是RIPC能調節它們的比率達到最適的網絡構成(見圖3H,P<0.05)。

圖1 遠隔缺血后適應能提高缺血小鼠的存活率，減少神經功能缺損、梗死體積、腦半球腫脹和腦萎縮。A、B：據腦區2、3、5-三苯基四唑氯化物染色的區域損失來測定梗死灶的體積(N=3)，給予RIPC后，梗死面積減少(P<0.05，與MCAO組相比)。C、D：與MCAO組相比，RIPC在3 d能顯著降低缺血側半球的腫脹(N=6) (P<0.05)。E、F:RIPC在14 d能顯著降低缺血側半球的萎縮(N=6) (P<0.05，與MCAO組相比)。 G:缺血再灌注后3 d、14 d用轉棒能力來評價神經功能。給予RIPC后，3 d、14 d的轉棒能力均有所提高(P<0.05)。H:RIPC 14 d的生存率顯著提高

圖2 遠隔缺血后適應改變缺血誘導的GFAP和GS的表達。在缺血再灌注3 d、14 d，我們用WB檢測缺血側GFAP及GS的表達。A～C:顯示缺血再灌注3 d后GFAP及GS的表達顯著升高，給予RIPC治療后，GFAP顯著降低(P<0.05，與MCAO組相比)，但GS無明顯變化(N=6)。D～F:結果顯示，在缺血再灌注14 d，GFAP逐漸增多(P<0.05，與SHAM組相比)，GS無明顯變化(與SHAM組相比)。 RIPC治療后，GFAP無明顯變化(與MCAO組相比)，但GS的表達顯著升高(P<0.05，與MCAO組相比) (N=6)。G:免疫熒光觀察缺血周邊區GFAP的表達(N=3)(×20)

圖3 遠隔缺血后適應調節星形膠質細胞亞型的比例。缺血再灌注3 d,A～D:可以看出MCAO后GFAPδ 的表達無明顯的改變而 GFAPα顯著增加(P<0.05與SHAM組相比)，導致 GFAPδ/GFAPα 的比率降低到1∶5。RIPC治療明顯降低缺血后GFAPα的表達(P<0.05與MCAO組相比)， 同時增加GFAPδ/GFAPα的比率(P<0.05與MCAO組相比)。14 d,E～H:WB檢測缺血側GFAPα 和 GFAPδ 的表達(N=6):MCAO后GFAPα的表達增加(P<0.05與SHAM組相比)，RIPC治療后GFAPα 和 GFAPδ 沒有明顯的變化，但是RIPC能調節它們的比率(P<0.05與MCAO組相比)

3 討 論

腦缺血導致過表達的激活和增生的星形膠質細胞，導致星形膠質細胞瘢痕的形成。細胞分子結構的改變，導致星形膠質細胞從營養保護神經元轉為釋放神經毒性，引起嚴重的神經元損害[12～14]。我們的研究證實RIPC能減少激活的星形膠質細胞，因此提高神經功能，減少死亡率，減少3 d梗死面積和缺血半球的腦腫脹，減少14 d的腦萎縮。

星形膠質細胞的活化是腦缺血的標志。由于細胞形態學的不同，星形膠質細胞組成成分也明顯不同。基因表達對損傷反應有益和有害雙重反應。星形膠質細胞分為兩大主要亞型，原漿型和纖維型。纖維型星形膠質細胞主要分布在白質，與少突膠質細胞相互作用提高髓鞘形成[15]。原漿型星形膠質細胞與神經元和毛細血管聯系，構成神經血管單元。因此，星形膠質細胞在突觸的發展和血腦屏障的調節中發揮重要的作用。GS是原漿型星形膠質細胞的標志，并且有許多功能，例如調節谷氨酸鹽的代謝、腦氨的解毒和同化、神經遞質的循環和神經信號的終止[16]。卒中后3 d，星形膠質細胞的亞型標志物GFAP和GS均增高，RIPC能顯著的降低GFAP的表達，但不能降低GS的表達水平，表明RIPC能顯著降低纖維型星形膠質細胞的表達，但對原漿型星形膠質細胞無影響。14 d缺血誘導的GFAP的表達經過RIPC治療后沒有顯著的差異。但是GS的蛋白表達水平經RIPC治療后顯著升高，以上的數據證實了持續的RIPC能夠影響星形膠質細胞亞型的表達，使星形膠質細胞從纖維型轉變為原漿型，因此降低了谷氨酸誘導的興奮性毒性及增加缺血后神經元的保護作用。

此外，反應性星形膠質細胞集中在白質并釋放大量的酸性蛋白，這在膠質瘢痕的形成過程中起著關鍵作用[17]。GFAP基因是被剪切的結合體，到目前為止，人類大腦中已經發現了10種不同的亞型。最經典的亞型是GFAPa，最大量的可變剪切變體是GFAPδ[18]，在健康的大腦中，GFAPa在腦室中表現為灰質和白質的星形膠質細胞，軟膜下和沿腦室起源于神經組織的星形膠質細胞，而GFAPδ則表現在較低的水平，主要表現在軟膜下和室管膜下起源于神經組織的星形膠質細胞。高表達的GFAPδ導致細胞網絡組的倒塌[19,20]，由于GFAPδ的增加或GFAPa的減少導致比率的改變會改變層粘蛋白和網蛋白的表達，影響細胞的黏附和遷移。已有報道GFAPδ在許多疾病中被誘導為反應性的星形膠質細胞[21]。本實驗中，缺血后GFAPa的表達顯著增高，但是GFAPδ的表達無明顯改變，RIPC治療后能降低的蛋白表達并明顯增加GFAPδ/GFAPα的比率，已有實驗顯示GFAPδ/GFAPα的比率為1∶3是GFAP最適的網絡組成[22]，在目前的研究中，RIPC不僅減少了總GFAP的表達，而且還調整了GFAPδ/GFAPα的比例，改變了GFAP的亞型，從而為GFAP的最佳網絡組成提供了幫助，并進一步改善了卒中后的神經功能。總而言之，GFAP在許多細胞過程中發揮作用。GFAP表達的改變可以促進突觸功能，改變谷氨酸-谷氨酰胺的代謝，從而擴大了星形細胞膜所接觸的神經元表面的面積。而且，GFAP亞型表達的改變能導致功能的改變，GFAP亞型比率的改變也能調整星形膠質細胞的功能并影響周圍的神經元。必須指出的是進一步研究GFAP特定的引物和闡明機制，結果，功能影響星形膠質細胞不同的亞群特定的網絡組成，這對RIPC的進一步治療和臨床轉化是有益的。

總之，目前的研究顯示 RIPC 可通過調節反應性星形膠質細胞的可塑性，在卒中后幫助恢復腦的神經功能。RIPC能直接影響膠質瘢痕的形成可能與減少梗死面積相關，這需要進一步證實。這個發現為RIPC提高缺血后神經功能的恢復提供了進一步的證據，并且表明長期實施RIPC可以減輕卒中后損傷。