建立杏仁核電刺激慢點燃和匹羅卡品化學點燃耐藥性顳葉癲癇模型并對比癲癇發作和海馬超微結構的變化

王麗琨，周 鑫，伍國鋒，洪 震

癲癇是多種原因導致的慢性腦部疾病，全球約有5000萬癲癇患者[1]，美國約有300萬[2]，我國約有900～1000萬[3]，且每年以新增45萬的速度遞增[4]。約有30%的癲癇患者經過系統正規的藥物治療，仍不能得到有效的控制，成為耐藥性癲癇。耐藥性癲癇模型則是研究耐藥機制及發現新的治療靶點的重要工具。杏仁核電刺激慢點燃癲癇模型是公認的顳葉癲癇的模型。但制作耗時耗力，難以點燃，植入的電極頭容易脫落和感染。而匹羅卡品癲癇模型也是理想的顳葉癲癇模型，急性期表現為癲癇持續狀態，隨后有大約2 w的潛伏期是異常興奮性環路形成的關鍵時期，慢性期主要表現為自發性反復發作，但死亡率較高[5]，且對大鼠的腦組織損傷較重。本實驗主要是對比兩種模型之間癲癇發作持續時間、發作頻率、發作級別、腦電圖和超微結構的差異，評估是否可用匹羅卡品模型來取代杏仁核電刺激慢點燃模型，以期能夠選擇出更適合研究耐藥機制的癲癇模型。

1 材料及方法

1.1 器材及試劑 DW-2000腦立體定向儀，BL-420F生物機能實驗系統,BL-420F刺激器，HF30型可拆式屏蔽室(成都泰盟科技有限公司制造)，鎳鉻漆包線(重慶儀表廠)，自制連接器，自制牙科鉆，自制深部電極，直徑0.1 mm，刺激電極。苯巴比妥注射液(上海新亞藥業有限公司)，卡馬西平(山東大學齊魯醫院)匹羅卡品、阿托品(美國Sigma公司)，苯妥英鈉純品(武漢遠城科技發展有限公司)。

1.2 實驗分組 健康成年雄性SPF級SD大鼠130只，體重180～220 g，平均(200.5±4.3)g，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。隨機選擇10只作為正常組，余下120只分別進行兩種模型制作。模型制作成功后分別選擇杏仁核模型和匹羅卡品模型，每組共10只進行對比癲癇發作的級別、頻率和發作的時間。

1.3 杏仁核耐藥顳葉癲癇模型的制作 實驗方法同本課題組先前發表的文章[6,7]雄性SD大鼠60只，模型制作成功后以苯妥英鈉(Phentoin，PHT)及苯巴比妥(Pentobarbital，PB)篩選耐藥模型，依據杏仁核后放電閾值(after discharges threshold,ADT)變化，應用抗癲癇藥物后與對照ADT比較，給藥后ADT不增加或增加小于20%為耐藥模型；ADT增高20%以上納入藥物敏感；ADT值變化不定不納入實驗分組。

1.4 匹羅卡品耐藥性顳葉癲癇模型的制作 選取雄性SD大鼠60只腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg[8～10]，直至出現4級及以上持續發作；癲癇持續狀態 (status epilepticus，SE)出現持續90 min后，用地西泮10 mg/kg終止發作。發生SE的大鼠約經過10 d～14 d潛伏期，即進入自發性發作階段。將14 d后有自發性發作的大鼠即為造模成功。在其右側杏仁核植入電極監測腦電圖，植入方法同前[6,7],使用24 h視頻腦電監護系統記錄大鼠發作頻率，持續時間及發作級別。用腦電圖監測杏仁核放電的情況，記錄腦電圖的頻率、波幅、發作持續時間，共記錄2 w。2 w后開始篩選耐藥模型，腹腔注射PB[11]，總量30 mg/kg，每天兩次，給藥過程共持續2 w，記錄發作次數和腦電圖變化；用PB后癲癇發作持續時間和發作頻率減少大于50%的為藥物敏感的大鼠；用PB后癲癇發作持續的時間和發作的頻率減少小于50%的為耐PB的癲癇大鼠[8,12]。對耐PB的癲癇大鼠，繼續選用卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)進行耐藥性篩選，CBZ灌胃，40 mg/kg/次，1 d 3次，連續給藥14 d。判斷方法如前。

1.5 電鏡標本制備及觀察判定 將動物麻醉后固定，開胸暴露心臟后以4%多聚甲醛灌注，灌注固定后取含有海馬結構的2～3 mm厚冠狀切面腦塊，然后用2.5%戊二醛進行固定。取皮質及海馬CA1區1 mm3組織各3塊，1%鋨酸固定2 h，丙酮脫水，環氧樹脂包埋0.1%醋酸鈾和3%檸檬酸鉛雙重電子染色5 min，H-600透射式電子顯徽鏡下進行超微結構觀察，每個組織塊觀察3個銅網，選擇病灶部位照像并病理分析，記錄海馬神經元超微結構變化。

2 結 果

2.1 杏仁核耐藥性癲癇模型制作 用SD大鼠60只制作模型，成功點燃31只，點燃成功率為51.6%。在點燃后僅有1只大鼠出現自發性發作，自發性發作率為3.33%。平均每只大鼠點燃約需6～10 w，31只完全點燃耗時約15 w。將31只癲癇大鼠進行耐藥篩選，2只死亡，29只中有10只對PHT耐藥，再進行PB的篩選，其中有2只是對PB敏感的，對兩種藥物耐藥的有8只，ADT值不定不能分組5只，藥物敏感大鼠16只，耐藥率為27.58%。每只癲癇大鼠要經過6 w的耐藥性篩選，篩選出這8只耐藥性癲癇大鼠耗時約20 w，近5 m。

2.2 匹羅卡品耐藥性癲癇模型制作 用SD大鼠60只制作模型，有自發性發作29只，成功率為48.33%，植入杏仁核電極后死亡3只，癲癇自發性發作率為100%。模型制作分為4批，每次15只，每周制作一批。約耗時6 w，共有26只大鼠進行耐藥篩選過程，其中對PB耐藥有15只，再行CBZ藥物篩選，其中3只對CBZ敏感，剩下的12只既對PB耐藥也對CBZ耐藥，共篩選出耐藥模型大鼠12只，不能分組3只，藥物敏感癲癇大鼠11只，耐藥率為46.15%，而杏仁核模型為27.58%。 可見匹羅卡品模型更易導致耐藥性癲癇模型。藥物篩選耗時4 w，制作匹羅卡品耐藥性癲癇模型約耗時10 w。

2.3 兩種模型的行為學對比 在癲癇發作的級別上，杏仁核模型發作Racine分級平均秩次為7.00;而匹羅卡平模型發作Racine 分級平均秩次為14.00(P=0.07)，兩種方法無顯著性差異,但匹羅卡品模型較杏仁核電刺激點燃模型癲癇發作持續的時間長，發作的頻率高(見表1)。

2.4 癲癇大鼠腦電圖變化 正常大鼠腦電圖波形頻率以5～10 Hz為主，波幅小于20 μV。杏仁核模型的癲癇發作時腦電圖頻率增加達到20～30 Hz，波幅增高達到80～90 μV；而匹羅卡品模型發作時的腦電圖則表現為頻率30 Hz以上，波幅100～1000 μV，以連續高波幅棘波、棘尖波或棘慢波、尖慢波發放為主(見圖1)。

2.5 耐藥性癲癇海馬組織超微結構變化 正常大鼠電鏡下神經元結構總體能觀察到豐富的細胞器，核膜完整的，線粒體和內質網正常。匹羅卡品敏感及耐藥模型的超微結構的損傷均較杏仁核嚴重(見圖2)。

2.6 耐藥性癲癇患者海馬組織超微結構變化 本課題組在臨床工作中收集了8例耐藥性癲癇患者的腦組織，這些患者是根據臨床表現、視頻腦電圖監測及神經影像學檢查確診為耐藥性顳葉癲癇的，通過多種的抗癲癇藥物長期不能控制癲癇的發作，行手術切除致癇灶，全部患者術中留取海馬、顳葉病灶腦組織作病理檢查，觀察顳葉癲癇患者病灶腦組織病理結構變化。電鏡結果提示：部分髓鞘增厚、水腫，髓鞘板層結構松解紊亂，神經元軸突水腫，神經膠質細胞水腫、細胞器減少。與上述匹羅卡品耐藥性癲癇大鼠表現基本一致，提示匹羅卡品模型方法可靠易行(見圖3)。

表1 杏仁核慢點燃模型與匹羅卡品模型發作持續時間及頻率

與杏仁核點燃模型組比較*P<0.05，有顯著性差異。由上表可見，匹羅卡品癲癇模型發作持續的時間及發作的頻率均較杏仁核電刺激模型增加

圖1 杏仁核模型及匹羅卡品模型大鼠腦電圖變化(A.正常腦電圖，以正常的α波和β波為主；B.杏仁核模型大鼠腦電圖，頻率19 Hz，波幅在100 μV以下，以連續發放的尖波為主；C.匹羅卡品模型腦電圖，頻率30 Hz，波幅在100 μV以上)

3 討 論

杏仁核模型成功率51.6%，匹羅卡品模型為48.33%。但是杏仁核模型有自發性癲癇發作的大鼠僅有1只，為3.33%，而匹羅卡品模型都有自發性發作，自發率為100%。所不同的是杏仁核模型從刺激開始到大鼠出現行為上的癲癇發作需要6～8 w，有時長達2個多月也沒有發作，只有棄用，耗時較長，31只完全點燃耗時約15 w。且需每天刺激，在刺激時大鼠煩躁異常，容易抓脫電極或者顱內感染導致實驗失敗；而匹羅卡品模型，從注射藥物開始30 min內即出現SE的表現，抽搐停止后2 w，若出現自發性癲癇發作，即為模型成功，模型制作相對簡便，29只制作成功的周期為6 w。模型成功后癲癇發作頻繁，癲癇發作持續時間和發作頻率都較杏仁核模型明顯增多，自發性發作率高。但匹羅卡品模型的死亡率較高為26.7%，實驗中死亡16只。

只有在普通癲癇模型的基礎上經過作用機制不同的兩種抗癲癇藥物治療足夠時間，仍然無效的才能認為是耐藥性癲癇模型。本實驗中對杏仁核和匹羅卡品模型，我們均用兩種作用機制不同的一線抗癲癇藥(PB、PHT或CBZ)進行耐藥性癲癇的篩選，杏仁核模型選用的是PHT和PB，耗時6 w,而匹羅卡品模型選用的是PB和CBZ，耗時4 w，原因是PHT和CBZ作用機制是基本一致的鈉通道阻滯劑，而PHT由于在臨床中應用副作用很大，已經逐漸退出臨床使用，所以在試驗過程中價格昂貴，購買困難。而CBZ目前廣泛的應用于臨床，是國際抗癲癇協會推薦的一線抗癲癇藥物，目前廣泛用作耐藥性模型的篩選[13,14]。

我們實驗結果表明杏仁核耐藥性癲癇耐藥率27.58%，匹羅卡品耐藥率為38.48%，篩選過程與Wang等使用馬桑內酯點燃制作的耐藥性癲癇模型類似[14]，篩選結果與Bethmann K等的研究結果相似[13]。本研究結果表明，無論是電點燃模型還是化學模型篩選出來的耐藥性癲癇動物均是客觀可靠的，但匹羅卡品模型耐藥率較杏仁核電刺激點燃模型耐藥率明顯升高，使用該模型制作耐藥顳葉癲癇模型成功率更高。耐藥性癲癇模型海馬細胞超微結構表現為核膜不完整、軸索變性水腫、線粒體變性，這些變化類似于Gao等近期發表的研究[15]，他們認為線粒體超微結構損傷與實驗性顳葉癲癇的長期發作密切相關，而且線粒體易于受到癲癇發作的損害。我們的耐藥性顳葉癲癇患者海馬組織標本提示髓鞘水腫、增厚、膜結構松解紊亂，實驗研究結果與此類似。上述研究結果從形態學上進一步證明了杏仁核點燃耐藥模型及匹羅卡品點燃耐藥模型的可靠性。

總之，兩種模型都是可靠的耐藥性顳葉癲癇的模型，杏仁核模型主要是對大鼠腦組織損傷小，能夠模擬人類癲癇發作過程，但制作過程復雜困難，耗時長，耐藥率低。而匹羅卡品模型制作簡便，自發率高，癲癇發作持續的時間及頻率高，超微結構破壞嚴重，更利于耐藥性機制的研究。

圖2 杏仁核及匹羅卡品模型海馬超微結構(電鏡×1500倍)。圖A～D為正常電鏡下神經元結構；B為杏仁核敏感組的海馬神經元：神經元形態有所改變，但核膜基本完整，可見線粒體腫脹，細胞器減少；E為匹羅卡品敏感組海馬神經元，E的損傷較B更為嚴重，胞體濃縮變性，核皺縮變形，核膜有輕度內陷，線粒體腫脹，粗面內質網腫脹變性，胞漿淡染，核膜不規則；C為杏仁核耐藥組海馬神經元，在B的基礎上可見部分髓鞘增厚、水腫，髓鞘板層結構松解紊亂，神經元軸突水腫，神經膠質細胞水腫；F為匹羅卡品耐藥組，在E的基礎上可見，粗面內質網減少，內質網的核糖體脫落，游離核糖體解聚，胞質中微絲增多， F的損傷較C更加嚴重。提示匹羅卡品耐藥模型的超微結構的損傷較杏仁核嚴重

A和C提示髓鞘增厚、水腫，部分髓鞘板層結構松解紊亂;B示神經元軸突水腫，神經膠質細胞水腫、細胞器減少

圖3 耐藥性癲癇患者電鏡下腦組織超微結構變化