瑞芬太尼緩解氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的SD大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用①

高 聰 林大勇 劉 兵 陳 峰

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院急診科，成都610072)

急性肺損傷 (Acute lung injury,ALI) 是敗血癥最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其常表現(xiàn)為嚴(yán)重的低氧血癥、肺水腫和肺部嗜中性粒細(xì)胞的大量堆積[1,2]。研究表明，ALI病理生理機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[3,4]。雖然目前已有多種方法用于治療ALI，但敗血癥誘導(dǎo)的ALI的死亡率仍居高不下[5,6]。因此急需尋找新的藥物及方法緩解ALI。瑞芬太尼是一類阿片受體激動(dòng)劑，具有起效快、易代謝等特點(diǎn)，適用于急危重癥的治療[7,8]。研究表明，瑞芬太尼可抑制過(guò)氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有抗氧化應(yīng)激的作用[9,10]。同時(shí)瑞芬太尼還可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制IL-6、IL-10等炎癥因子的釋放緩解小鼠敗血癥的發(fā)展，通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)減輕小鼠ALI[11，12]，但其肺保護(hù)作用是否與調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激有關(guān)還有待探究。因此，本研究將采用LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型，以探究瑞芬太尼對(duì)大鼠肺組織氧化應(yīng)激的作用及作用機(jī)制，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 瑞芬太尼購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為H200301970。臨用前用無(wú)菌生理鹽水將瑞芬太尼注射液稀釋。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只雄性SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。體重200～220 g。所有大鼠自由進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，并于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS,貨號(hào)：L2880) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。IL-6、IL-1β和干擾素-γ (Interferon-γ,IFN-γ) ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。丙二醛 (Malondial-dehyde,MDA) 和超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase,SOD) 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。Ki67、半胱天冬氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT一抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器 HBS-1096A酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)儀器公司；E100生物顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型復(fù)制及給藥 將24只SD大鼠隨機(jī)分為健康 (Control) 組、內(nèi)毒素 (LPS) 組和內(nèi)毒素+瑞芬太尼(LPS+Remi)組，LPS+Remi組大鼠于造模前1 h尾靜脈注射瑞芬太尼稀釋液 1 μg/kg，其余兩組注射等量生理鹽水。1 h后除Control組外，其余兩組大鼠腹腔注射LPS 15 mg/kg，健康組則注射等量生理鹽水。造模后4 h處死大鼠，取全血和肺組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取相同部位肺組織，用4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片。將切片脫蠟處理后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)組織切片進(jìn)行染色，并于顯微鏡下每片隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3免疫組化 取石蠟切片置于67℃烘箱中烘片2 h，進(jìn)行脫蠟。脫蠟后滴加3% H2O2封閉過(guò)氧化物酶，用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)；PBS清洗3次后用5% BSA室溫封閉2 h，滴加適宜濃度一抗 (Ki67,1∶200;Caspase-3,1∶150) 于4℃封閉過(guò)夜，第2天洗去一抗，滴加生物素標(biāo)記二抗室溫封閉1 h，最后滴加DAB顯色，于生物顯微鏡下拍照記錄，用Image J軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4ELISA 將所取全血室溫靜置1 h后，4℃ 3 500 r/min 離心15 min，取上層血清根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β和IFN-γ的含量。

1.2.5MDA、SOD含量檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA濃度，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定大鼠SOD活性。

1.2.6Western blot 將組織剪碎至1 mm3大小，用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后調(diào)平各組蛋白濃度，用10%SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。PBS清洗3次后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗 (p-PI3K,1∶1 000;p-AKT,1∶1 000;PI3K,1∶1 800;AKT,1∶1 200) 4℃封閉蛋白質(zhì)過(guò)夜。第2天棄去一抗，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫封閉1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光液，曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠肺細(xì)胞增殖及凋亡的影響 TUNEL和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組比較，LPS組大鼠肺組織凋亡小體數(shù)顯著增多(P<0.05)，同時(shí)增殖標(biāo)記蛋白Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，凋亡標(biāo)記蛋白Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增多(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Remi組大鼠凋亡小體數(shù)明顯減少(P<0.05)，同時(shí)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少 (P<0.05)。見(jiàn)圖1～3。

2.2瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠炎癥反應(yīng)的影響 與Control組比較，LPS組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β和IFN-γ濃度明顯升高 (P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Remi組大鼠血清中IL-6、IL-1β和IFN-γ濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖1 瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響

圖2 瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠肺組織Ki67表達(dá)的影響

圖3 瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠肺組織Caspase-3表達(dá)的影響

2.3瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠氧化應(yīng)激的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS組大鼠血清SOD濃度與Control組大鼠比較顯著降低 (P<0.05)，LPS+Remi組大鼠SOD濃度明顯升高，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；此外，與Control組比較，LPS組大鼠血清MDA濃度明顯升高 (P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Remi組大鼠血清MDA濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖4 瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠血清炎癥因子含量的影響

圖5 瑞芬太尼對(duì)ALI大鼠血清SOD和MDA濃度的影響

圖6 瑞芬太尼對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

2.4瑞芬太尼對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 與Control組比較，LPS組大鼠p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值明顯升高 (P<0.05)；LPS+Remi組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值與LPS組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討論

LPS誘導(dǎo)ALI是目前制備動(dòng)物ALI模型最常用的方法[13]。研究表明，內(nèi)毒素是引起人體ALI最常見(jiàn)的原因，其外膜主要成分LPS可激活炎癥介質(zhì)表達(dá)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，還可誘導(dǎo)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，類似人體ALI的病理表現(xiàn)，因此成為國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的建立ALI動(dòng)物模型的方法[14-16]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法，腹腔注射LPS，復(fù)制大鼠ALI模型[17]。根據(jù)細(xì)胞凋亡情況及肺組織的炎癥反應(yīng)表明模型復(fù)制成功。

炎癥因子的大量釋放是ALI最常見(jiàn)的病理表現(xiàn)[16,18]。炎癥因子可通過(guò)破壞肺組織毛細(xì)血管完整性，使血管通透性增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)肺水腫，導(dǎo)致機(jī)體呼吸功能障礙[19]。IL-1β是炎癥反應(yīng)最早產(chǎn)生的炎癥因子之一，其可通過(guò)誘導(dǎo)IL-6和IFN-γ等炎癥因子的釋放誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[20]。大量研究表明，阿片受體激動(dòng)劑瑞芬太尼對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物具有肺保護(hù)作用，其可通過(guò)抑制炎癥因子釋放而緩解ALI[12,21]。本文研究結(jié)果表明，瑞芬太尼能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放，降低ALI大鼠血清IL-6、IL-1β和IFN-γ的濃度，進(jìn)一步表明瑞芬太尼具有減輕ALI炎癥反應(yīng)的作用。

氧化應(yīng)激是由氧化自由基及其消除分子之間調(diào)控失衡所誘導(dǎo)的反應(yīng)，過(guò)度的氧化應(yīng)激是造成ALI的重要原因[22,23]。過(guò)量活性氧的產(chǎn)生可抑制抗氧化分子的生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成[24,25]。研究表明，氧化應(yīng)激還可增加內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞通透性，損傷肺泡上皮細(xì)胞功能，加速肺損傷[26]。內(nèi)生抗氧化物是機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的第一道防線，如SOD[27]。SOD可分為SOD1、SOD2和SOD3三種類型，SOD1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，SOD2主要存在于線粒體，而SOD3則主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)中[28]。SOD可通過(guò)清除肺部超氧化陰離子和亞硝酸鹽的堆積抑制肺部氧化應(yīng)激的發(fā)生[24]。研究表明，SOD含量與肺損傷呈負(fù)相關(guān)[29]。Yoon等研究發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼可通過(guò)抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[10,30]。本文研究發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼能顯著降低ALI大鼠血清MDA的濃度并能促進(jìn)SOD的分泌，表明瑞芬太尼能夠?qū)筁PS誘導(dǎo)的ALI氧化應(yīng)激，從而減輕ALI大鼠肺損傷。

研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡可加速肺泡毛細(xì)血管破壞[31]。細(xì)胞凋亡是多種分子機(jī)制共同調(diào)控的結(jié)果。炎癥因子的大量釋放可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。自由基的產(chǎn)生可能會(huì)直接激活線粒體細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[27]。半胱氨酸蛋白酶 (Caspase) 家族是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，抑制Caspase活性可減輕PMN誘導(dǎo)的小鼠ALI。我們已經(jīng)證明瑞芬太尼具有抗LPS誘導(dǎo)ALI的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的功能。此外，瑞芬太尼還能顯著抑制ALI大鼠肺組織凋亡小體的形成及Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)還能促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)記分子Ki67的表達(dá)。研究表明，活性氧可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示瑞芬太尼能通過(guò)下調(diào)肺組織氧化應(yīng)激抑制ALI大鼠肺組織細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

此外，本文研究還發(fā)現(xiàn)LPS可促進(jìn)ALI大鼠肺組織PI3K和AKT磷酸化，表明LPS可誘導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路激活。預(yù)先給予大鼠瑞芬太尼能顯著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值，表明瑞芬太尼能抑制LPS誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。已有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的調(diào)控。提示瑞芬太尼通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減緩大鼠ALI的作用可能與其調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述，瑞芬太尼可通過(guò)調(diào)控ALI大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕LPS誘導(dǎo)的ALI，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究?jī)H初步探討了瑞芬太尼減輕大鼠ALI的作用及作用機(jī)制，對(duì)于其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。