波動性高糖對糖尿病視網膜病變的作用研究進展

董天慧，孫建梅，姚舜，鄒斌倩，蒲澤南，何雷

近年來，隨著糖尿病病人人數逐年上升，糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)已成為全球主要致盲原因之一。23.0%的糖尿病病人出現DR[1]，其中非增生性DR及增生性DR發病率分別為19.1%和2.8%[2]。DR的特征性病理改變表現為周細胞喪失和新生血管形成，臨床根據有無視網膜新生血管的出現將DR分為非增殖期DR(non-proloferative diabetic retinopathy，NPDR)和增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。目前，已被證實的DR發病危險因素包括糖尿病病程，高血糖，高血壓及血脂紊亂。糖化血紅蛋白(HbA1c)反映糖尿病病人近2～3個月血糖平均水平，是反映血糖長期控制的指標，美國糖尿病協會將HbA1c作為糖尿病及其并發癥預防監控“金標準”[3]，但在長期血糖水平與HbA1c相近的人群中，DR的發生與病程缺乏完全的一致性[4]，且與日內平均血糖漂移幅度有顯著關聯性，說明波動性高糖所引起的生物效應對DR的危險性的作用可能超過血糖絕對水平的作用。近年來多項研究指出，波動性高糖能通過細胞自噬，細胞凋亡，氧化應激及視網膜組織DNA損傷，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放加速糖尿病進程參與DR的發生和進展。筆者就波動性高糖與DR之間的關系進行如下綜述。

1 波動性高糖對DR的影響

2013年中國2型糖尿病防治指南中推薦2型糖尿病病人控制目標為HbA1c<7%[5]。但目前很多研究表明，僅僅用HbA1c不足以評估糖尿病病人的血糖控制情況，糖尿病并發癥的發生及嚴重程度還與血糖波動有關。波動性高糖，又稱血糖漂移，是糖尿病病人的血糖在較高水平基礎上圍繞均值上行、下行雙向的急性波動，被認為是監測短期血糖變化的主要指標，并可通過自測血糖系統(self-monitored blood glucose，SMBG)或動態血糖監測系統(continuous glucose monitoring system，CGMS)獲取血糖波動水平[6]。王程琳[7]采用CGMS監測60例HbA1c值無明顯差異的2型糖尿病病人的連續72 h血糖，發現DR病人的平均血糖水平，平均血糖波動幅度和日間血糖平均絕對差均高于眼底正常的2型糖尿病病人，提示血糖波動是DR發生的重要因素之一，且較HbA1c的預測更為準確。另有研究表明，NPDR病人血糖波動系數及糖尿病病程明顯小于PDR病人，但兩組HbA1c及空腹血糖差異無統計學意義，提示血糖波動也是預測DR病程進展的獨立危險因素之一[8]。有學者認為，在慢性高糖狀態下，細胞可通過反饋調節部分拮抗高糖毒性作用，而當細胞處于葡萄糖濃度強烈波動狀態時，該適應性調節作用減弱，導致高糖毒性增強。因此在糖尿病病程較長的DR病人中，應重視病人的血糖波動幅度，爭取平穩降糖，以免加重DR病情進展。

2 波動性高糖引發DR的發病機制

2.1 波動性高糖與細胞凋亡 細胞凋亡又被稱為Ⅰ型程序性細胞死亡，其典型的形態學特點是DNA碎片化、染色質凝聚、核固縮、胞質皺縮、胞膜空泡化、凋亡小體形成。覆蓋視網膜毛細血管的周細胞減少是DR中首先出現的病理改變及顯著特征，已有研究證實糖尿病視網膜毛細血管周細胞丟失與細胞凋亡密切相關[9]。周細胞最重要的功能是調節血管形成并穩定其功能。對人視網膜細胞體外培養[10]顯示，缺乏周細胞的毛細血管仍可有完整的內皮細胞，但微動脈瘤和新增生血管通常缺乏周細胞，提示周細胞的缺失使內皮細胞的增生失去控制，發生非VEGF誘導的新生血管形成。周細胞凋亡還可導致毛細血管通透性改變，視網膜微血管滲漏，繼而導致微血管基底膜增厚，管腔窄縮和血流改變，促使DR后期發生視網膜缺血缺氧及新生血管形成，最終發生牽拉性視網膜脫離。Beltramo等[11]的實驗顯示，離體培養24 h后，波動高糖組周細胞出現明顯凋亡現象，恒定高糖組周細胞未發生凋亡，而恒定高糖組在轉入波動高糖環境下后在24 h內出現細胞凋亡，且凋亡相關分子Bax含量與DNA斷裂程度呈正相關。另外一項周細胞體外培養顯示，波動性高糖環境下五種凋亡相關分子包括Fas配體(Fas ligand，FasL)，激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)，細胞凋亡調控蛋白tBid，轉錄因子p53蛋白 和凋亡前體蛋白Bax含量較恒定高糖條件明顯增加，其中FasL增加最為顯著，而tBid，p53 和Bax增加幅度較小，但恒定高糖培養下的周細胞只有FasL含量明顯增加，提示波動性高糖最有可能通過caspase-8激活途徑誘發周細胞凋亡進程[12]。并且有文獻表明，大幅波動的血糖也可通過激活細胞內Ca2+依賴的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)介導周細胞凋亡[13]，Wu等[14]的體外實驗也證實波動高糖較穩定高糖可更強烈地激活PKC，誘導周細胞凋亡。此外，另有研究發現波動性高糖可下調抗凋亡因子Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)前體水平，并上調凋亡前體蛋白Bax的線粒體轉位和caspase-3 p17蛋白表達水平，促進微血管內皮細胞的凋亡，并加重視網膜缺血缺氧狀態和微血栓形成[15]。

2.2 波動性高糖與細胞自噬 自噬以自噬體形成為特征，其激發的細胞死亡不依賴于caspase的加入，自噬體及其內的成分通過自身的溶酶體系統，在酸性環境和溶酶體酶的作用下被清除。自噬引發的細胞死亡有別于凋亡引發的Ⅰ型程序性細胞死亡，因而稱之為Ⅱ型程序性細胞死亡。其中人視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)自噬又與DR的發生進展密切相關[16]。RPE位于脈絡膜和視網膜神經上皮層之間，是通過緊密連接互相交織的單層細胞，參與加強血-視網膜屏障功能，因此RPE細胞層損傷后，血-視網膜屏障功能障礙，引起視網膜滲出、出血及水腫(糖尿病性黃斑水腫)，血管內大分子物質如纖維蛋白進入細胞外基質中形成纖維蛋白凝膠，允許和支持新生血管和基質細胞的內向生長，誘發DR的發生進展[17]。另有研究表明，細胞自噬失控是糖尿病血管內皮細胞發生失穩態的關鍵因素，并且參與了糖尿病視網膜新生血管形成，通過抑制自噬可在一定程度上抑制新生血管形成，延緩DR進程[18]。宋建[19]發現對比波動性高糖培養環境下RPE細胞ARPE-19的自噬體數量明顯多于恒定高糖組，且前者自噬相關蛋白LC3含量明顯增高而自噬中間媒介p62蛋白明顯降低，提示波動性高糖條件下RPE細胞自噬行為更為活躍。此外，該研究還發現波動性高糖條件下，RPE細胞內可見大量高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)從細胞核釋放到細胞質內，并較恒定高糖組有明顯增多，而使用丙酮酸乙酯阻斷HMGB1的釋放后，ARPE-19細胞內的自噬水平顯著降低。而另有研究表明胞質內HMGB1主要通過與抗凋亡蛋白Bcl-2競爭自噬基因Beclin-1上的結合位點，形成HMGB1-Beclin-1復合物，誘導自噬啟動[20]。因此這也間接證明血糖波動條件下，ARPE-19細胞的自噬啟動，是由HMGB1介導的，并最終誘發了DR的發生進展。

2.3 波動性高糖與氧化應激及視網膜組織DNA損傷 氧化應激被認為是糖尿病微血管并發癥的重要發病機制之一。視網膜在糖尿病缺血缺氧條件下，線粒體內呼吸鏈電子傳遞受抑制，活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量產生[21]。此外，高血糖及波動又可作為刺激因素進一步引發ROS水平上升[22]，胞內ROS最主要的攻擊目標是DNA，其中DNA的斷裂最為常見。此外，ROS又可通過下游多元醇通路激活、氨基己糖途徑、PKC通路、糖基化終末產物增加導致DR的發生進展[23]。譚芳[24]發現血清丙二醛與餐后血糖波動幅度(postprandial glucose excursion，PPGE)成正相關，提示餐后血糖波動可加劇氧化應激的發生，且DR病人PPGE顯著高于未合并糖尿病微血管病變的糖尿病病人，因此推測血糖波動可能通過增強氧化應激誘發DR的發生。而李立琴[25]在對ARPE細胞離體培養發現與恒定性高糖相比，波動性高糖環境下不僅血清丙二醛生成增加，且抗氧化指標超氧化物歧化酶活性及谷胱甘肽含量下降，炎性因子細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表達量增加，提示波動性高糖可能通過加劇氧化-抗氧化機制的不均衡以及氧化應激下炎癥反應導致DR的發生。蓋春柳等[26]報告糖尿病大鼠視網膜組織存在 DNA損傷，血糖波動可加重該損傷，并認為血糖波動具有獨立于持續高血糖以外的損傷作用。此外，在波動性高糖刺激下，Müller細胞合成誘導型一氧化氮合酶增加[27]，并生成過量的一氧化氮，一氧化氮作為自由基，參與氧化應激，誘導細胞凋亡、引起組織細胞損傷。

2.4 波動性高糖與VEGF VEGF是一種分子量約48 kDa的同型二聚體糖蛋白，其分子家族包括胎盤生長因子、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，其中VEGF-A又稱血管通透因子，Klettner等[28]認為其是DR發生發展的關鍵因素。人VEGF-A基因可通過選擇性剪切產生至少6種主要異構體，其中VEGF165是誘導血管生成、增加通透性和激發炎癥反應的主要活化因子[29]。VEGF與受體結合后通過誘導視網膜毛細血管炎癥反應，上調視網膜局部ICAM-1并增加白細胞黏附造成視網膜白細胞瘀滯，破壞血-視網膜屏障，增加視網膜局部血管通透性，促進血管內皮細胞穿越基底膜后遷移和增殖，刺激視網膜新生血管形成誘發DR的發生進展[30]。研究發現血清VEGF和血小板源性生長因子-BB含量與平均血糖波動幅度，日內最大血糖波動幅度成正相關。徐麗麗[31]在不同條件下培養RPE72 h后，間斷高糖組較恒定高糖組細胞胞體薄，形態不規則，且前者較后者VEGF含量明顯增高。Sun等[32]發現在間歇性高糖環境下培養的人視網膜血管內皮細胞(human retinal endothelial cells，HRECs)VEGF基因轉錄和表達水平及線粒體產生的ROS水平較恒定高糖環境下有明顯上升，并且通過使用抗氧化劑錳卟啉或2-噻吩甲酰三氟丙酮阻斷ROS的作用，可使VEGF表達下調，推測間歇性高糖可能通過某種機制誘發線粒體產生過量ROS，并進一步通過氧化應激通路激活核因子-κB，最終導致HRECs內VEGF表達上調。此外，人視網膜周細胞也是分泌VEGF的主要細胞之一，而其表達的miR-126分子可通過抑制周細胞表達VEGF負向調控視網膜血管內皮細胞和周細胞的增殖和侵襲能力，從而抑制DR的發生進展[33]。Mazzeo等[34]發現間歇性高糖培養下周細胞表達miR-126較恒定高糖培養環境有明顯下調，并導致間歇性高糖環境下周細胞分泌VEGF明顯增加，但該研究并未發現兩種環境下血小板衍生因子和Ang-2通路發生激活，提示間歇性高糖可能只是通過抑制miR-126，上調VEGF表達誘發DR發生。

3 總結

綜上所述，理想的血糖控制不僅要爭取血糖水平和HbA1c達標，同時要注意減輕糖尿病病人的血糖波動。波動性高糖可通過啟動細胞自噬和細胞凋亡，激活氧化應激，損傷視網膜組織DNA，促進VEGF的釋放等多種途徑參與DR的發生進展，確切完整的機制尚需進一步研究。