結直腸癌發病相關的lncRNA篩選及GAPLINC對HCT116細胞的作用

羅育其 溫敏杰 于海濤

廣州市第一人民醫院南沙醫院普通外科（廣州511457）

CRC患者的臨床表現缺少特異性，主要表現為腹痛、便血和大便習慣改變，其確診有賴于腸鏡檢查［1］，但目前CRC的早期診斷率低，影響其治療效果。lncRNA在表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平上對基因的表達進行調控，具有重要的生物學意義，其異常表達往往與腫瘤的發生發展有關［2-3］。PCR基因芯片技術可實現對基因表達差異的高通量篩選，具有靈敏、可靠的特點，是研究腫瘤基因表達異常的有效工具［4］。因此，本研究擬根據文獻報道，通過lncRNA PCR芯片篩選CRC相關差異性表達的lncRNA，并挑選差異表達較明顯的lncRNA進行大樣本的臨床標本及功能驗證。

1 材料與方法

1.1 臨床標本準備

3對lncRNA PCR篩選標本和21例CRC組織標本均取自于2011年7月—2015年9月廣州市第一人民醫院普通外科患者手術標本，腫瘤組織取自非中央壞死部分，正常結直腸黏膜組織取自于距腫瘤邊緣5 cm以上，標本-80℃低溫保存。

1.2 lncRNA PCR芯片實驗

組織標本的總RNA提取采用Trizol法，試劑盒購于Invitrogen公司，相關操作按試劑盒說明書進行。提取的總RNA的濃度和純度送往上海英拜科技生物有限公司進行質檢。根據文獻報道、Emsable數據庫、Reseq和UCSC基因瀏覽器內的相關資源，確定84個于人類腫瘤發病相關的lncRNA制備成lncRNA PCR芯片（由上海英拜生物科技有限公司合成）。將提取的RNA反轉錄為cDNA，所用的試劑盒為RT2 First Strand Kit（330401，Qiagen，Hilden，Germany），然后將cDNA溶于100μL的雙蒸水中，在lncRNA PCR芯片上每孔滴加1μL的cDNA溶液進行實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測，lncRNA PCR芯片上每個微孔中含有不同目的基因的引物，RT-qPCR反應采用RT2 SYBR Green Mastermix試劑盒（Qiagen，330401），所有操作均按試劑盒說明書進行，PCR的反應條件為：95℃，聚合酶激活/變性10min；95℃，15s擴增，60°C，1min收集熒光（40循環）。根據腫瘤標本和正常對照標本Ct值比較得出基因表達的差異。

1.3 21對臨床標本驗證GAPLINC的表達差異

經lncRNA芯片實驗確定候選研究lncRNA GAPLINC后，在21對臨床標本中利用RT-qPCR進一步驗證其表達差異?？俁NA的提取和反轉錄為cDNA的方法與上一步驟相同。通過Primer6軟件設計引物，GAPLINC引物序列為：GAPLINC-F5'-GCTTCTCTGCGTTCACACAC-3'；GAPLINC-R5'-TTCACAGAACTGCATACACATCA-3'，由上海生工生物工程公司合成。RT-qPCR的的參數為：95℃，聚合酶激活/變性10min；95℃，15s擴增，60°C，1min收集熒光（40循環）。所得的Ct值除以內參基因GAPDH的Ct值，得到校正后的表達量。

1.4 HCT116細胞培養

實驗所需的CRC細胞株HCT116購自于中科院上海細胞庫，細胞置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基中，5%CO2和95%空氣培養箱中培養；恒溫37℃，濕度95%，培養瓶細胞生長融合75%～85%時傳代，每天觀察一次，隔天換液。

1.5 GAPLINC表達質粒和siRNA細胞轉染

克隆GAPLINC全長序列到pcDNA3.0載體，由上海英拜生物科技有限公司完成；由上海吉碼生物科技有限公司合成GAPLINC小干擾RNA（siRNA）。利用Lipofectamine?2000試劑盒進行細胞轉染，轉染siRNA前一天將細胞鋪至六孔板中，每孔約2×105個細胞。24小時后，觀察細胞密度達到80%～90%左右時，使用Lipofectamine?2000將目的siRNA及陰性對照siRNA轉染進細胞中。用不含血清和抗生素的RMPI1640分別稀釋Lipofectamine?2000、質粒和siRNA，常溫孵育5min。將稀釋好的質粒和siRNA和Lipofectamine?2000混勻，常溫孵育20min。孵育好的混合物均勻滴加到孔板中。轉染24～48 h后吸去培養基，用1×PBS洗三遍，徹底清除未轉進細胞的質粒和siRNA，收獲細胞，進行熒光定量PCR檢測轉染和沉默效率。

1.6 細胞遷移、侵襲（Transwell）實驗

細胞遷移：實驗前先將Transwell chamber（購于CORNING公司）放在37℃培養箱中溫育，消化待測細胞，用PBS和無血清培養基先后洗一次，用無血清培養基重懸細胞，計數，調整濃度為2×105/mL。在下室（即24孔板底部）加入600～800μL含10%血清的培養基，上室加入100～150μL細胞懸液，放入培養箱。24 h后用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30min。取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800μL結晶紫染液的孔中，室溫染色15～30min。輕輕用1×PBS沖洗浸泡3次，每次5min，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；顯微鏡下取9個隨機視野計數，統計結果。

細胞侵襲實驗步驟同遷移實驗，使用膠原包被好的chamber（transwell biocoat）。

1.7 細胞凋亡檢測

將不同處理48 h后的各組細胞消化下來，使用預冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的細胞懸液。流式試管中加入100μL細胞懸液，按下表加入5μL Annexin V與5μL核酸染料PI：

表1 細胞凋亡實驗處理

輕輕混勻，室溫避光處放置15min。各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μL。1小時內上流式細胞儀檢測。根據檢測結果統計PI+Annexin-V+細胞占所有細胞的百分比。

1.8 統計方法

結果采用均數±標準差表示，全部數據采用SPSS19.0統計軟件分析，多組間均數比較采用方差分析；兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA PCR芯片檢測結果

為了篩選CRC相關的lncRNA，本研究選用3例臨床樣本，取腫瘤組織（T）和癌旁對照組織（N），利用人lncRNA PCR芯片進行檢測?？偣灿^察了腫瘤相關的84個基因，結果提示有21個lncRNA在腫瘤組織中低表達，3個lncRNA在腫瘤組織中高表達，60個lncRNA表達無差異（圖1）。在這些差異性表達的lncRNA中，GAPLNC在腫瘤組織中表達量增加（倍增數＞3，P＜0.05），且各樣本中表達量相對穩定，因此選擇GAPLNC為候選lncRNA，進一步研究其在CRC中的發生發展機制。

圖1 lncRNA芯片各基因表達的差異（A 84個lncRNA的表達情況；B lncRNA表達差異的可視化熱圖，紅色表示表達增加，藍色表示表達減少。）

2.2 21對臨床配對標本驗證GAPLNC表達情況

為了進一步驗證GAPLNC在CRC組織與癌旁正常對照組織表達差異，本研究選用21對臨床樣本進行驗證，結果提示GAPLNC在腫瘤組織中表達增加（t=3.56，P=0.0013，圖2A）。應用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價正常組織和CRC組織的區分度，結果提示ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.893，P＜0.05，具有良好的敏感度和特異度（圖2 B）。

圖2 21對臨床樣本GAPLINC表達情況（A正常組織和腫瘤組織GAPLINC的表達差異；B GAPLINC的ROC曲線）

2.3 增加或抑制GAPLINC的表達對CRC細胞凋亡的影響

CRC細胞株HCT116轉染GAPLINC表達質?；騭iRNA后，RT-qPCR檢測表明，GAPLINC在細胞內表達增高或降低（圖3）；將pCDNA3.1-GAPLINC轉染HCT116細胞，處理48 h后用流式細胞術檢測細胞凋亡程度，結果提示細胞凋亡受到明顯抑制，與對照組相比，細胞凋亡比例降低，有統計學意義（4.1±1.1%vs 12.37±2.08%，t=6.08，P=0.0037，圖3）。GAPLINC siRNA轉染CRC細胞，RT-qPCR結果提示，siRNA抑制CAPLINC表達效果良好（圖2）；siRNA轉染細胞48 h后，與對照組比較，流式細胞術檢測提示CRC細胞凋亡比例顯著增加（31.13±5.60%vs 12.37±2.08%，t=5.443，P=0.0055，圖3）。

圖3 HCT116細胞轉染GAPLINC表達質粒和si RNA后GAPLINC的表達情況

2.4 增加或抑制GAPLINC的表達對CRC細胞遷移及侵襲能力的影響

HCT116細胞轉染GAPLINC表達質粒后，與對照組比較，其細胞遷移、侵襲能力增高（圖5），有統計學意義（表2），GAPLINCsiRNA轉染細胞，實驗結果表明，抑制GAPLINC表達后，CRC細胞遷移、侵襲能力得到抑制（圖5，表2）。

3 討論

CRC的治療取得了長足的進步，目前仍采用手術治療為主的綜合治療，術后的腫瘤復發是影響治療效果的一個主要因素。對于Ⅰ和Ⅱ期患者而言，其5年生存率可達到75%～95%，而Ⅲ期患者5年生存率只有30%～50%。因此，為進一步改善CRC患者治療效果，實現CRC的早期診斷顯得尤為重要。目前可用來篩查診斷CRC的手段有限，而國內50%的CRC患者均為Ⅱ期以上，使CRC的治療效果大打折扣。因此，探尋CRC特異的分子標志物、影響CRC發生發展的相關分子用于早期診斷或靶向治療具有重要意義［5］。

基因的表達在各個層次受到各種分子物質的調控，lncRNA因其長度大于200 nt，具有與編碼RNA類似的結構，可與同源DNA（轉錄lncRNA的基因及序列相似的基因）序列結合、亦可與同源RNA序列結合、還因其可折疊成復雜的二級結構，可以蛋白質相互結合，在基因表達過程中起著重要作用［6-7］。目前已有大量的lncRNA被證實可能與CRC的發生發展有關，如HOXB-AS3、lncRNA-422、CLMAT3及LOC554202等［8-9］。本研究結合文獻報道，選擇84個與腫瘤發生發展密切相關的lncRNA，制備lncRNA PCR芯片，進行CRC發病相關的lncRNA篩選。芯片實驗結果表明，CRC組織中存在大量的lncRNA表達異常，84個lncRNA中有24個lncRNA存在差異性表達，有統計學意義，其中21個表達下降，3個表達增加。lncRNA在CRC表達差異主要表現為表達量降低；這些表達下降的lncRNA多具有抑癌基因的功能，如PCAT29具有抑制細胞分裂的作用；TARID可使腫瘤抑制因子TCF21去甲基化而發揮抑癌作用［8］

圖4 HCT116細胞轉染GAPLINC表達質粒后siRNA后細胞凋亡改變

圖5 HCT116細胞轉染GAPLINC表達質粒及siRNA后細胞遷移、侵襲能力的改變（HE染色，×400；A細胞遷移情況；B細胞侵襲情況）

表2 增加或抑制GAPLINC表達后HCT116細胞遷移和侵襲能力的改變

LncRNA PCR芯片篩選結果顯示，GAPLINC在CRC組織表達穩定增高，被選定為下一步臨床標本驗證及功能實驗的lncRNA。GAPLINC基因位于人類18號染色體短臂上，長924 bp，轉錄后RNA長度為643 nt［10］。研究表明，在常氧狀態下，GAPLINC具有促進細胞生長及延緩死亡的作用，它還有助于細胞在缺氧狀態下生存；Bcl-2/Bax比例是調節細胞凋亡的“分子開關”，GAPLINC通過結合miR-211抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達，而沉默GAPLINC則增加Bax的表達，減少Bcl-2的量，進而使Bcl-2/Bax比例降低，促進細胞凋亡進程［11-12］。因此，GAPLINC具有促進胃癌細胞的增殖和侵襲，與腫瘤的分期及患者的預后不良密切相關［13］。本研究通過lncRNA芯片實驗確定候選研究lncRNA為GAPLINC后，對其差異性的表達進行了大樣本的臨床標本驗證，結果與胃癌組織類似，在CRC組織中GAPLINC亦高表達，構建ROC曲線，其AUC為0.892，有統計學意義，表明GAPLINC對區分正常組織和CRC組織具有良好的特異度和敏感度，也可利用其對CRC的癌組織及癌旁正常對照組織進行區分。此外，本研究實驗結果表明，轉染GAPLINC表達質粒增加GAPLINC在CRC細胞內表達后，CRC細胞細胞凋亡比例下降；此外，GAPLINC過度表達后，CRC的遷移、侵襲能力增強；相反地，構建siRNA轉染CRC細胞抑制GAPLINC的表達后，CRC細胞的細胞凋亡比例增加，細胞遷移及侵襲能力減弱，這表明GAPLINC在CRC中發揮著促癌作用。因此，GAPLINC在CRC發生發展過程中可能起著重要的作用，具有潛在的臨床意義。