慢性乙型肝炎患者血清與糞便HBV DNA水平對比研究

王 明，張 抒，李 明，文 君，鄭振江

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）分布于全身各組織和器官，在血液、乳汁、唾液、尿液、胃液等不同體液均可檢出，但不同部位HBV DNA水平和傳染性可能存在一定的差異。一般認為，血液HBV DNA水平最高，其傳染性也就最強[1]。上世紀70年代初國內外學者就公認HBV主要通過非腸道方式傳播，但最新的臨床研究發現部分無輸血、注射或手術史的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者家屬，存在血清HBsAg陽性的家庭聚集現象，表明HBV的腸道傳播途徑可能一直被忽略。血清HBV DNA是判斷HBV感染和復制的重要指標。由于HBV可存在于膽汁、胃液和腸液內，所以消化道液HBV檢測的陽性率也很高[2]，而目前糞便中是否存在HBV及糞便HBV DNA與肝功能的關系研究得還較少。肝腸起源于相同的胚層，因此它們的結構和功能有許多相似之處而被稱之為“肝-腸軸”。部分腸道微生物及其代謝產物可以經常達到肝臟，激活Toll樣受體/Nod樣受體（TLR/NLR）信號通路，導致肝臟炎癥，并可能與肝功能損傷程度相關[3]，但CHB患者腸道微生物種群的變化及其與HBV DNA的相關性尚未有報道。本研究檢測了CHB患者糞便HBV DNA，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年8月～2017年3月在我院就診的CHB患者73例，男46例，女27例；平均年齡（43.91±15.08）歲。符合2015年發布的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標準[4]，入選患者血清HBsAg陽性＞1年、血清ALT≥正常值上限2倍、未接受過抗病毒治療、既往無消化道出血病史或糞潛血試驗陽性者。排除標準：合并甲型、丙型、丁型等其他肝炎病毒感染者、肝硬化或入組前3個月服用過可能導致肝損害的藥物、合并自身免疫性肝病、心腦腎等器官進展性疾病、妊娠或哺乳期婦女。受試者了解研究內容并自愿簽署知情同意書。本研究得到本院醫學倫理委員會同意并書面批準。

1.2 檢測指標 晨起采集肘靜脈血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存。采用ELISA法檢測血清HBV標記物（上海江萊生物科技有限公司）；采用FQ-PCR法檢測血清HBV DNA水平（試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司生產，檢測儀器為羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀并使用其配套軟件分析數據）；收集糞便400 mg，分為2份，分別保存于2個Eppendorf管（-80℃保存）。使用QIAmp DNA Stool kit試劑盒抽提糞便總DNA，采用Applied Biosystems熒光定量PCR儀及其配套試劑采用FQPCR法檢測HBV DNA。將糞便與緩沖液充分混勻，置于95℃ 孵育5 min，室溫靜置后加入蛋白酶K（蘇州奧維科生物科技有限公司），加入乙醇沉淀DNA，洗脫后備用。HBV DNA特異性引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，以提取的總DNA為模板進行兩輪反應，取最后一輪PCR產物行0.5%瓊脂糖凝膠電泳。血清和糞便HBV DNA的定量單位為copies/ml（將糞便HBV DNA以檢測出的拷貝數乘以3.5×10-4換算成copies/mg[5]，檢測靈敏度為1×103copies/ml）。腸道菌群DNA的檢測：檢測種類包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌、梭菌屬、白色念珠菌、擬桿菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌等9種腸道菌群，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。以提取的糞便總DNA為模板，操作方法按照說明書要求進行，采用25μl反應體系，擴增反應條件：95℃預變性5 min，60℃ 1 min，72℃ 45 s，82℃延伸 5 s，循環 40 次，72 ℃ 10 min，結束。取PCR反應產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用相應的引物和模板進行熒光定量PCR反應，得到不同拷貝數量的熒光強度，于UVP凝膠成像系統（上海書俊儀器設備有限公司）中分析擴增結果。

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，采用“Kolmogorov-Smirnov”法對計量資料行正態性檢驗，對符合正態分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，計數資料以百分率描述，組間比較采用x2檢驗，HBV DNA與不同變量的相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 在入組的73例CHB患者中，輕度21例，中度47例，重度5例。其中48例血清HBeAg陽性患者糞便和血清HBV DNA水平均顯著高于25例血清 HBeAg陰性患者（t=4.401，P=0.024；t=5.936，P=0.008，表 1）。

2.2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平的比較 不同臨床分度CHB患者糞便和血清HBV DNA定量水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05，表2）。

2.3 相關性分析 糞便與血清HBV DNA呈正相關（r=0.61，P=0.002）；糞便HBV DNA與血清ALP和TBIL 呈負相關（r=-0.49，r=-0.54，P＜0.05），而血清HBV DNA與血清ALT或AST呈負相關（r=-0.46，P=0.023；r=-0.52，P=0.008，表 3）。糞便 HBV DNA與腸球菌呈正相關（r=0.49，P=0.005），而血清HBV DNA與乳酸桿菌呈負相關（r=-0.53，P＜0.001），其余腸道菌群與HBV DNA無明顯相關性（表4）。

表1 73例CHB患者實驗室指標（±s）

表1 73例CHB患者實驗室指標（±s）

與HBeAg陰性組比，①P＜0.05

ALT（U/L） 684.3±420.8 細菌 DNA （lgcopies/ml）AST（U/L） 493.3±335.1 雙歧桿菌 7.5±1.2 ALB（g/L） 38.3±5.5 乳酸桿菌 8.4±1.6 GGT（U/L） 131.1±72.7 腸桿菌 8.1±1.2 ALP（U/L） 112.6±58.4 腸球菌 6.9±1.0 TBIL（μmol/L） 42.6±42.9 梭菌屬 9.2±1.3糞便HBV DNA5.5±1.7 白色念珠菌 6.7±0.5（lg copie s/ml）HBeAg陽性（n=48） 5.9±1.6① 擬桿菌 9.7±1.2 HBeAg陰性（n=25） 5.0±1.9 普雷沃氏菌 9.5±1.8血清HBV DNA6.4±1.4 瘤胃球菌 5.9±0.8（lg copies/ml）HBeAg陽性（n=48） 7.2±1.6①HBeAg陰性（n=25） 6.1±1.3

表2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平（lgcopies/ml±s）比較

表2 不同臨床分度CHB患者HBV DNA水平（lgcopies/ml±s）比較

血清糞便輕度 21 4.9±2.3 6.4±1.8中度 47 5.7±1.9 6.8±2.1重度 5 5.5±2.2 6.1±1.9 F 2.005 1.847 P 0.147 0.216

表3 HBV DNA與血生化指標的相關性分析

表4 HBV DNA與腸道細菌的相關性分析

3 討論

下消化道有大量正常微生物寄生和繁殖，腸道微生物在人體營養、免疫、抗感染和抗癌等多種生理過程中起重要作用，腸道還是誘導抑制性T淋巴細胞（主要分泌免疫抑制因子）分化成熟的關鍵場所[6]。肝功能不全患者幾乎都可出現腸道功能下降，肽聚糖等多種微生物代謝產物的移位還可以加重慢性肝病的進展[7]。基礎研究發現CHB患者腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌、假絲酵母菌水平明顯上升[8]，也有研究發現血清HBV載量與腸道滲透性、微生物群落構成改變有關[9]。侵入人體而未被單核-吞噬細胞系統清除的HBV可到達肝臟或膽管、胰腺、淋巴結等肝外組織，同時HBV DNA對理化物質的抵抗力較強，胃酸難以滅活。因此，CHB患者腸道通常可見大量HBV DNA復制，但CHB患者的糞便是否具有傳染性及其流行病學意義迄今未明確[10]。定量PCR檢測HBV復制水平操作簡便，同時敏感性和可重復性較高，隨著糞便DNA提取技術的進步，近年來糞便HBV DNA的定量檢測逐步應用于臨床[11]。胃液和腸液均可檢測到HBV DNA。因此，HBV可能在腸道內生存并復制[12]，但HBV與腸道菌群的相互影響目前尚不明確。本研究發現的糞便HBV DNA檢測的陽性結果進一步佐證了HBV在腸道內復制的學說，CHB患者腸道內存在HBV DNA。

血清HBeAg陽性患者處于病毒復制活動期和強傳染期。本組血清HBeAg陽性患者糞便HBV DNA載量顯著高于血清HBeAg陰性患者，表明血清HBV DNA水平高，病毒處于復制期時腸道內HBV同樣處于復制活躍期[13]。也有研究認為CHB患者胃黏膜存在HBV感染，說明HBV不僅可以侵犯肝臟，也可能侵犯胃黏膜并進行復制[14]。當完整的HBV顆粒進入腸腔后，其表面的HBsAg保護其不被胃液和腸液破壞，因此在排出體外的糞便中可以檢測出HBV DNA。由于前C區（G1896A）和BCP區（A1762T/G1764A）突變可能影響HBeAg的產生，HBeAg陰性患者血清HBV檢測也可以為陽性，而且HBV復制并未受到影響[15]，因此本研究HBeAg陰性患者血清和糞便HBV DNA均為陽性，表明HBV處于復制活動期，結果進一步支持血清和糞便HBV DNA對HBV的復制活動均有較高的提示意義。本研究發現在不同臨床類型的CHB患者HBV DNA定量無明顯差異，可能與本研究納入的重度CHB病例過少，亦可能由于重度患者經過多年反復免疫損傷，使肝內HBV DNA復制下降，其病情與HBV DNA復制水平的確切關系還有待進一步研究。

HBV感染導致的肝組織病理性損傷過程是病毒與宿主免疫系統相互作用的結果，目前對HBV DNA載量與肝臟損害程度的關系尚無確切的結論[16]。有研究認為血清HBV DNA載量與肝功能指標相關[17]，而本研究發現血清HBV DNA載量與血清ALT和AST呈負相關，表明HBV DNA水平與肝功能損害程度的關聯有待確定。同時，糞便HBV DNA與ALT和AST無關，而與ALP和TBIL呈負相關，我們認為糞便HBV DNA可能與膽管損傷有關，因此糞便和血清HBV DNA對消化系統損傷的提示作用不同。HBV感染的不同時期均可出現腸道菌群的改變，包括無癥狀HBV攜帶者、CHB和失代償型肝硬化，而有害菌群的上升和有益菌群的下降是最常見的改變，但HBV對腸內微生物生態影響的原因尚不明確[18]。腸球菌科屬于腸道非優勢菌群，通常在特定的環境下才能衍生出侵襲性而對人體造成傷害，而且CHB患者體內的腸球菌科細菌可能異常增多[19]。本組腸球菌與糞便HBV DNA呈正相關，而血清HBV DNA與乳酸桿菌呈負相關，表明血清和糞便HBV復制分別與乳酸桿菌或腸球菌失衡的程度相關。因此，我們認為血清和糞便HBV DNA對腸道菌群紊亂的提示價值不一致，與有關研究[20]結果基本相同。

綜上所述，血清和糞便HBV DNA可反映HBV的復制水平，而對反映肝功能和腸道菌群紊亂的價值不同，但確切的關系尚有待進一步研究。