慢性乙型肝炎患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比的變化及其臨床意義探討

周積云，馬 勇，丁體龍，涂遠航，陳 策

自提出共刺激通路激活機制后，CD28分子成了免疫學研究的熱點[1-4]。CD8+CD28+T淋巴細胞又被稱為細胞毒性T淋巴細胞，其可通過釋放穿孔素、顆粒酶和特殊的細胞因子殺傷靶細胞[5-8]。已有文獻報道，在結腸癌患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞比例較正常人降低，而在自身免疫性疾病和鉤蟲感染患者外周血，其比例則升高[9，10]，表明CD8+CD28+T淋巴細胞數量的降低與疾病的發生存在一定的關系，因為后者對機體免疫應答狀態有重要的影響。本研究檢測了處于不同感染階段的CHB患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比，以探討其變化與免疫應答的關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年4月～2018年8月蚌埠市解放軍第902醫院肝病中心收治的CHB患者88例，男性56例，女性32例；年齡為11～67歲，平均年齡為34.9±13.3歲。符合2015年中華醫學會感染病學分會和肝病學分會聯合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”的診斷標準[11]。分組標準定義免疫耐受期為血清HBsAg和HBeAg陽性，血清HBV DNA水平＞200 000 IU/mL，血清ALT水平正常，肝組織學檢查無明顯異常或輕度的炎癥，無或僅有輕度的肝纖維化；免疫清除期為血清HBV DNA水平＞2 000 IU/mL，血清ALT水平持續或間歇升高，肝組織學表現為中度或嚴重的炎癥壞死，肝纖維化明顯或進展；非活動期為血清HBeAg陰性，抗-HBe陽性，血清HBV DNA水平低或檢測不到（＜2 000IU/mL），血清ALT水平正常，肝組織學無炎癥或輕度炎癥；再活動期為血清HBeAg陰性，抗-HBe陽性，HBV DNA 呈中等至高水平復制（＞20 000 IU/mL）,血清ALT水平持續或反復異常，肝組織學無炎癥或輕度炎癥。排除標準：已進行抗病毒治療的非初治患者、脂肪性肝病、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病或合并其他病毒感染的慢性肝病、近兩個月來應用過糖皮質激素、α-干擾素等影響免疫功能的藥物的患者。另在解放軍第902醫院體檢中心選擇健康成人20例，男性13例，女性7例；年齡21～56歲，平均年齡為33.0±10.0歲。所有納入人群簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會審批。

1.2 檢測方法 使用DxP Athena流式細胞儀（美國CYTEK公司）檢測外周血CD8+CD28+T淋巴細胞，抗 CD3-FITC、抗 CD3-APC、抗 CD8-PE-Cy7、抗CD28-APC和抗mIgG1-APC（美國BD公司）。取流式管，分別加入抗體和外周血50 μL，充分混勻，避光染色30 min；加入紅細胞裂解液2 mL，避光10 min；1500 r/m離心5 min，棄上清；加入SB 1.5 mL，1500 r/m離心5 min，棄上清；加20 g/L PFA 200 μL，4℃避光保存或上機檢測。每次實驗均設置陰性對照管、每種熒光抗體的補償調節管和抗CD28的同型對照管。應用Flowjo軟件進行數據分析。使用Roche cobase 411儀器（瑞士Roche公司）采用電化學發光法檢測外周血HBsAg水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析，計量數據以（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同感染階段的CHB患者與健康人外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比比較 見表1和圖1～5。

表1 不同人群外周血指標和CD28+T淋巴細胞（%±s）比較

表1 不同人群外周血指標和CD28+T淋巴細胞（%±s）比較

與健康人比，①P＜0.05；與免疫耐受期患者比，②P＜0.05

例數 HBV DNA（lg copies/mL） ALT（U/L） HBeAg/抗HBe（U/mL） CD8+CD28+T淋巴細胞健康人 20 - 25.0±8.2 -/- 26.1±3.5免疫耐受期 20 8.1±0.7 34.4±10.6 145.4±32.4/- 26.3±3.4免疫清除期 28 5.9±1.3② 206.3±71.6①② 131.1±35.3②/- 40.1±4.7①②非活動期 20 - 42.7±7.0 -/53.7±4.6 20.3±2.2再活動期 20 6.8±1.2 320.0±77.1① -/54.0±5.5 21.9±2.2

圖1 健康人外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比

圖2 免疫耐受期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比

圖3 免疫清除期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比

圖4 非活動期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比

圖5 再活動期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比

2.2 不同血清HBsAg水平的CHB患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比 見表2。

表2 不同HBsAg水平患者CD8+CD28+T淋巴細胞百分比（%±s）

表2 不同HBsAg水平患者CD8+CD28+T淋巴細胞百分比（%±s）

與HBsAg低水平組比，①P＜0.05；與HBsAg中度水平組比，②P＜0.05

血清HBsAg（IU/ml） 例數 CD8+CD28+T淋巴細胞0～500 32 24.0±7.5 500～2000 28 28.4±8.9①＞2000 28 33.2±8.5①②

3 討論

CD28分子是由220個氨基酸組成，被糖基化等修飾形成為44kDa的同源二聚體，為二硫鍵所連接，位于細胞表面，配體為 B7-1（CD80）和 B7-2（CD86）[12，13]。CD28 分子主要表達于 95%CD4+T淋巴細胞和50%CD8+T淋巴細胞表面。CD28與B7配體的結合為T細胞活化、增殖提供第二信號。特異性細胞免疫是慢性乙型肝炎機體特異性清除病毒的關鍵，同時也是造成肝臟急、慢性炎癥損傷的關鍵。

本研究對88例慢性乙型肝炎患者和20例健康成人外周血進行了檢測，發現在不同病程階段患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比有明顯的差異。在慢性乙型肝炎自然病程中，免疫耐受期一般出現在HBV感染早期，表現為血清HBV載量高（＞200000IU/mL），肝臟無明顯損傷或僅表現為輕度的炎性損傷。本研究結果顯示，免疫耐受期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比與正常對照組相比差異無統計學意義（P＜0.05），可能與肝臟內調節性T淋巴細胞對CD8+CD28+T淋巴細胞增殖、分化起到抑制作用有關。肝臟作為人體內最大的代謝器官及免疫器官，具有雙重血液供應，其3/4的血液來自門靜脈系統，使肝臟組織在更大程度上面對食物和腸道微生物的刺激，做出反應。同時，肝臟需要生成無數新的抗原物質，其本身的這種特殊解剖結構及功能使其具有免疫耐受傾向的特點。“慢性乙型肝炎防治指南”不建議對免疫耐受期患者進行抗病毒治療[11]。

國內有學者對HBV感染免疫耐受期患者進行肝臟組織學檢查和外周血ALT檢測表明，免疫耐受期患者表現為ALT正常或僅輕度異常，但肝臟組織活檢顯示大部分患者肝臟均出現炎癥，部分已出現肝纖維化,免疫耐受期是導致HBV感染慢性化的重要原因之一[14]。因此，通過誘導CD8+CD28+T淋巴細胞增殖、分化，從而打破HBV感染的免疫耐受，提高抗病毒應答及血清轉換，來防止HBV感染慢性化，可作為治療慢性乙型肝炎的一個思路。

同時，本研究結果顯示免疫清除期患者CD8+CD28+T淋巴細胞百分比明顯高于正常對照組及其他病程階段組，此時CD28大量表達，CD28/B7共同刺激通路激活，通過分泌穿孔素以及激活FasL對HBV進行殺傷作用，在清除期表現為血清HBV DNA載量下降，血清轉氨酶升高，肝臟組織有炎性損傷或壞死，表明CD8+CD28+T淋巴細胞與機體清除病毒以及肝臟損傷都密切相關，也說明了CD28的激活是把雙刃劍。在低復制期患者外周血CD8+CD28+T淋巴細胞水平低于正常對照組，隨著病程慢性化，HBV對肝臟的長期慢性損傷，可能導致肝臟對病毒的刺激敏感性降低，即使處在再活動期時，僅能激起CD8+CD28+T淋巴細胞的輕度升高，但仍低于正常人。不同病程階段慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T淋巴細胞水平的差異導致不同階段肝臟免疫功能狀態不同，使肝臟對HBV的清除以及肝臟自身炎癥、壞死、纖維化的進展也各不相同。因此，針對慢性乙型肝炎的階段化治療至關重要。

HBV的外膜（envelope）蛋白是由S基因編碼合成的，主要包括大蛋白、中蛋白和主蛋白（即HBsAg）[15]。HBsAg由226個氨基酸組成，攜帶全部抗原反應表位，是臨床檢驗是否感染HBV的一項重要指標。檢測HBsAg較簡單，特異性、敏感性強，被廣泛應用于臨床[16，17]。在臨床治療中，僅出現持續病毒學和（或）出現HBeAg血清學轉換，并不能達到治愈的標準，只有出現持續的HBV檢測不到且伴有HBsAg轉陰和（或）出現抗-HBs才能達到完全治愈，HBsAg在臨床檢測HBV感染以及慢性乙型肝炎治療中有重要的指導作用。有研究表明，HBsAg水平與慢性乙型肝炎病程具有相關性，其中在免疫耐受期其水平最高，其次為免疫清除期，低復制期HBsAg 水平最低[18，19]。本研究發現，HBsAg 水平與CD8+CD28+T淋巴細胞具有相關性，HBsAg量越高，外周血CD8+CD28+T淋巴細胞百分比越高。因此，HBsAg水平在一定程度上可間接反映肝臟免疫反應激活的程度，從而指導臨床治療。

CD28分子驅動細胞內重要的生化反應，包括特殊磷酸化、轉錄以及重要細胞因子的產生，在T細胞增殖及活化過程中起到了重要的作用。已有動物實驗表明，應用CD28分子拮抗劑可預防自身免疫性疾病和器官排斥反應[20，21]。在慢性乙型肝炎抗病毒治療過程中，不同病程階段機體對抗病毒藥物的敏感性不同，與機體免疫系統功能狀態有關，是否可以通過CD28分子激活劑來提高機體CD8+CD28+T淋巴細胞的增殖，從而提升機體對乙型肝炎病毒的殺傷作用，以提高抗病毒應答率，以及利用CD28拮抗劑在非活動期減緩肝臟炎性損害，減緩慢性乙型肝炎病程進展，有待下一步研究。