膽石癥患者血清微小RNA-122、高遷移率族蛋白1和角蛋白-18水平及其臨床意義*

程鐵軍，張明智

血清學指標對膽石癥也具有一定的判斷價值，miR-122、高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB 1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋白-18（cysteine aspartate protease cleavage keratinocyte-18，CCK-18）曾作為急性肝損傷的標志物，因為miR-122僅表達于肝細胞，通過調節膽固醇和脂肪酸代謝，參與膽結石的發生和發展[1-4]，而HMGB 1和CCK-18是由免疫細胞和壞死細胞釋放的具有促炎活性的核結合蛋白，兩者均為肝上皮細胞的標志物[5]。動物實驗表明[6]，膽管結扎后動物血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高。本研究檢測了膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平變化，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2018年2月我院收治的膽石癥患者201例，男性69例，女性132例；平均年齡為（49.6±6.1）歲。所有膽石癥患者均經超聲和CT檢查診斷，其中膽色素型膽管結石68例（33.8%）、膽固醇型膽管結石71例（35.3%）、混合型膽管結石61例（30.8%）。BMI為（23.9±3.9）kg/m2。根據疾病嚴重程度，將患者分為單純性膽石癥組（n=97）和復雜性膽石癥組（n=104）。復雜性膽石癥診斷標準[7]為：（1）膽囊纖維化嚴重或Calot三角粘連、瘢痕化、脂肪堆積、分離難度大；（2）膽囊前三角區與后三角區之間界限不清；（3）膽囊嚴重炎性水腫或萎縮。符合其中1項者，則診斷為復雜性膽石癥。納入標準為：（1）膽囊結石診斷明確，伴或不伴繼發性膽總管結石；（2）無梗阻性黃疸表現。排除標準：（1）伴有急性膽道感染；（2）合并膽道腫瘤；（3）伴有嚴重的膽源性胰腺炎；（4）入組前曾接受過外科治療患者。選擇同期健康體檢者103例作為對照，男性45例，女性58例；平均年齡為（50.5±5.8）歲，BMI為（23.5±3.5）kg/m2。兩組人群性別、年齡和BMI比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者簽署知情同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 觀察指標 采用RT-PCR法測定血清miR-122水平；采用ELISA法測定血清HMGB 1和CCK-18水平（試劑盒購自上海創祥生物科技有限公司）。

1.3 統計學分析 應用SPSSS 22.0和Medcalc 16.2軟件進行統計學分析。首先進行正態性分布檢驗，對正態分布的計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。對非正態分布的計量資料以【M（Q1，Q3）】表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。計數資料以n（%）表示，采用卡方檢驗。以患者病情嚴重程度為因變量，以Child分級、肝硬化、膽結石分期、腹腔積液、血清白蛋白、miR-122、HMGB 1和CCK-18作為自變量，建立Logistic回歸模型，構建miR-122、HMGB 1和CCK-18診斷的ROC曲線，計算曲線下面積（AUC）。取約登指數（靈敏度+特異度-1）最大處作為各指標診斷復雜性膽石癥的截斷點。P＜0.05被定義為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比較 膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平均顯著高于健康人，差異有統計學意義（P＜0.05，表 1）。

表1 兩組血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比較

表1 兩組血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比較

膽石癥健康人統計值P例數201 103 miR-122 4.7（0.9，14.3）0.9（0.4，3.1）6.107＜0.001 HMGB1（ng/mL）2.5±0.7 2.1±0.4 6.332＜0.001 CCK-18（U/L）126.8±20.5 101.4±18.7 10.845＜0.001

2.2 不同嚴重程度膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比較 97例單純性膽石癥患者血清 miR-122、HMGB 1和 CCK-18水平分別為 3.5（0.7，8.5）、（2.2±0.5） ng/mL 和（112.4±19.4） U/L，顯著低于104例復雜性膽石癥患者【分別為5.8（0.9，16.2）、（2.8±0.8） ng/mL 和 （140.2±23.5） U/L，Mann-Whitney U=3.107，P=0.016；Mann-Whitney U=6.241，P＜0.001；Mann-Whitney U=9.171，P＜0.001】，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的單因素分析 單因素分析顯示，兩組在性別、年齡、BMI、既往手術史和糖尿病方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而兩組在肝硬化和腹腔積液方面比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 影響復雜性膽石癥發生的單因素[n（%），（±s）]分析

表2 影響復雜性膽石癥發生的單因素[n（%），（±s）]分析

單純性（n=97） 復雜性（n=104） x2/t P性別男32（33.0） 37（35.6） 0.149 0.699女65（67.0） 67（64.4）年齡（歲） 52.4±6.5 51.3±5.2 1.319 0.187 BMI（kg/m2）23.7±4.024.1±4.30.6830.494肝硬化是26（26.8） 69（66.3） 18.418 ＜0.001否71（73.2） 35（33.7）既往手術史有13（13.4） 18（17.3） 0.587 0.444無84（86.6） 86（82.7）糖尿病是20（20.6） 25（24.0） 0.338 0.561否77（79.4） 79（76.0）腹腔積液是24（24.7） 47（45.2） 9.187 0.002否73（75.3） 57（54.8）

2.4 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的多因素分析 將單因素分析有統計學意義的因素，如肝硬化、腹腔積液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18作為自變量，將膽石癥嚴重程度作為因變量納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示，肝硬化、腹腔積液、miR-122、HMGB 1和CCK-18水平為單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的危險因素（表3）。

2.5 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平聯合檢測診斷復雜性膽石癥的效能分析 在單指標檢測方面，血清CCK-18與miR-122或HMGB 1比，其診斷效能差異無統計學意義（Z=0.839，P=0.401；Z=1.266，P=0.206）；應用血清 miR-122、HMGB 1和CCK-18水平聯合檢測診斷復雜性膽石癥的模型為：F=-7.098+0.309×miR-122+1.297×HMGB 1+0.019×CCK-18，即聯合檢測診斷復雜性膽石癥的AUC顯著高于miR-122或HMGB 1單指標檢測（Z=2.694，Z=3.419，P=0.007，P=0.001，表4，圖 1）。

表3 影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的多因素分析

圖1 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18聯合檢測診斷復雜性膽石癥的ROC曲線比較

表4 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18聯合檢測診斷復雜性膽石癥的效能分析

3 討論

血清學指標在診斷膽結石等疾病中表現出一定的優勢，其不受膽結石解剖位置的影響，可以較好地預測膽結石患者的病情，為臨床治療提供依據[8-11]。我們檢測了膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平變化，并探討了三者與膽石癥病情的關系，以期為臨床早期判斷膽石癥患者病情提供參考。

miR-122在肝臟特異性表達，占肝臟miRNA總量的70%，具有調節脂肪酸及膽固醇代謝的功能[12]。HMGB 1和CCK-18均為機體內促炎性蛋白，為肝細胞炎性標志物。動物實驗[13]表明，當膽囊受到損傷時，血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平呈現升高的趨勢。本研究結果顯示，膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平顯著高于健康人，提示其可作為判別膽結石患者病情的潛在生物學指標。本研究結果顯示，復雜性膽石癥患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平顯著高于單純性膽石癥患者，更提示其與患者病情的關系。為進一步分析影響單純性膽石癥進展為復雜性膽石癥的相關危險因素，本研究采用單因素和多因素Logistic回歸分析，結果顯示存在肝硬化、有腹腔積液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高為復雜性膽石癥的危險因素。在肝硬化時，患者肝功能受損，影響了胃腸激素的滅活，促進了膽結石的發生發展[14-16]。在肝功能受損后，腹腔積液增多且白蛋白水平降低，腹腔積液的長期存在和低蛋白血癥易導致膽囊壁增厚，甚至膽囊纖維化，導致膽囊收縮能力下降，膽汁淤積，形成結石[17，18]。miR-122通過抑制脂肪酸和膽固醇代謝，造成膽囊膽固醇過量積聚，導致結石形成[19]。CCK-18為參與膽囊運動調節的激素，CCK-18水平升高，胰腺消化酶分泌減少，誘發膽囊結石進一步發展[20]。本研究同時分析血清miR-122、HMGB 1和CCK-18診斷復雜性膽石癥的效能，結果顯示，三者單獨檢測時，AUC值介于0.7～0.8之間，而采用三者聯合檢測診斷復雜性膽石癥，結果顯示可將診斷的AUC提高至0.819，顯著高于三者的單獨檢測，表明聯合檢測可最大限度地避免對病情的誤判。