慢性丙型肝炎患者外周血濾泡輔助性T淋巴細胞表面PD-1受體表達及意義研究*

吳 靜，東保吉，吳 超

抗病毒治療慢性丙型肝炎（CHC）患者的療效受多種因素的影響，其中基線血清HCV RNA水平就很重要[1]。一般認為，CHC患者血清病毒水平越低，則治療療效越好，治療效果也會受到HCV特異性細胞毒性 T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）活性的影響[2]，該特異性T細胞能夠清除HCV，提高治療效果[3]。本研究檢測了180例CHC患者外周血濾泡輔助性 T淋巴細胞（follicular helper T cells，Tfh）表面程序性死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）的表達情況，并檢測了血清白細胞介素21（IL-21）水平，以探討不同血清病毒載量的CHC患者外周血Tfh細胞表面PD-1表達的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年8月～2017年8月在我院就診的CHC患者180例，男119例，女61例；年齡為22～59歲，平均年齡為（47.31±9.65）歲；平均病程為（7.5±3.14）年。符合丙型肝炎防治指南的診斷標準[4]。納入標準：血清HCV RNA≥3 lg copies/ml，人類白細胞抗原（HLA）-A2陽性。排除標準：合并其他肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染、有自身免疫性疾病史、嗜酒史、應用肝毒性藥物、應用過口服抗病毒藥物、α-干擾素和免疫調節劑者。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 檢測方法 采用熒光定量PCR法檢測血清HCV RNA（試劑購于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用ELISA法檢測血清抗-HCV（試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司）；使用日立7600全自動生物化學分析儀檢測血生化指標；使用貝克曼庫爾特公司生產的FC500流式細胞儀檢測外周血T、B淋巴細胞亞群、白細胞HLA-A2等位基因型、外周血Tfh和Tfh細胞表面PD-1陽性率（試劑盒均購于深圳市康百得生物科技有限公司）；采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測血清白細胞介素21（IL-21，試劑盒購于武漢博士德生物有限公司）。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組檢測指標比較 根據血清HCV RNA水平進行分組，結果血清低病毒載量組76例，3 lg copies/ml≤血清 HCV RNA＜6 lg copies/ml；高病毒載量組104例，血清HCV RNA≥6 lg copies/ml。高病毒載量組Tfh細胞表面PD-1陽性率顯著高于低病毒載量組（P＜0.01），而Tfh細胞百分比和血清IL-21水平均顯著低于低病毒載量組，差異有統計學意義（P＜0.01，表 1）。

2.2 兩組外周血T、B細胞百分比比較 高病毒載量組外周血CD4+T、CD4+T/CD8+T比值和CD19+B細胞百分比均顯著低于低病毒載量組，而外周血CD8+T細胞百分比顯著高于低病毒載量組，差異有統計學意義（P＜0.01，表 2）。

表1 兩組檢測指標（%±s）比較

表1 兩組檢測指標（%±s）比較

例數 HCV RNA（lg copies/ml） Tfh細胞表面PD-1陽性 Tfh細胞百分比 IL-21（ng/L）低病毒載量 76 4.5±1.2 26.2±2.2 7.9±0.7 46.8±1.3高病毒載量 104 6.4±0.7 37.2±1.1 5.1±0.4 21.7±1.1 t 9.216 35.368 21.496 105.534 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 兩組外周血T、B細胞（±s）比較

表2 兩組外周血T、B細胞（±s）比較

例數 CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+T/CD8+T比值 CD19+B（%）低病毒載量組 76 51.1±4.6 24.0±3.1 3.3±0.2 16.7±3.9高病毒載量組 104 37.6±4.4 31.7±3.9 2.3±0.1 11.8±3.2 t 13.492 10.923 26.192 6.761 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 兩組外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞表面PD-1陽性表達百分比的比較 高病毒載量組CD4+T細胞和CD8+T細胞表面PD-1陽性百分比均顯著低于低病毒載量組，差異有統計學意義（P＜0.01，表 3）。

表3 兩組外周血CD4+和CD8+T細胞表面PD-1表達（%±s）的比較

表3 兩組外周血CD4+和CD8+T細胞表面PD-1表達（%±s）的比較

CD8+T細胞PD-1陽性低病毒載量組 76 10.1±2.3 6.3±2.2高病毒載量組 104 2.4±0.6 1.0±0.3 t 26.640 18.413 P＜0.01 ＜0.01例數 CD4+T細胞PD-1陽性

3 討論

Tfh細胞主要在T淋巴細胞亞群中起作用，同時其本身還能夠通過分泌IL-21使病毒激活細胞毒性T淋巴細胞，使慢性乙型肝炎患者能夠獲得持續的抗病毒免疫[5]。Meissner et al研究表明，濾泡輔助性T細胞在慢性HCV感染性疾病發病過程中參與免疫反應應答[6]。Tfh表面存在一種PD-1受體，這種分子能抑制Tfh細胞表面分子的表達。在這種條件下，IL-21和HCV特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）將無法更好地發揮作用，清除HCV的能力受到阻礙[7]。

慢性HCT感染患者外周血CD4+T細胞的效應降低，而CD8+T細胞功能相對增強，該反應變化與HIV感染患者類似[8]。T淋巴細胞發揮持續應答需要接收到三個信號：一個是通過T細胞釋放的應答因子傳遞；二是通過T細胞受體傳遞；三是通過T細胞表面表達抗原提呈細胞（APC）共刺激分子傳遞[9]。這三個信號缺一不可，缺失任一個都將導致T細胞功能障礙。在這么多條共同刺激信號的傳遞中，起負向協同作用的PD-1的刺激分子和它的配體B7-H1被認為是與HCV感染時間持續時間有關[10]。我們前面提到了免疫細胞抑制性共刺激分子PD-1與它的配體（programmed death ligand-1，PD-L1）發生作用后會釋放出抑制免疫的信號，降低T淋巴細胞反應，T細胞反應包括凋亡、抑制T細胞增殖和誘導細胞走向衰竭。Mcgary et al發現CHC患者外周血T細胞PD-1百分比明顯增高[11]。Miller et al認為PD-1百分比增加是因為HCV核心蛋白與補體Clq R兩者之間發生相互作用的結果[12]。

本研究發現，血清高病毒載量的CHC患者HCV RNA和Tfh細胞表面PD-1陽性率均顯著高于低病毒載量組，而Tfh細胞百分比和血清IL-21水平均顯著低于低病毒載量組，表明核心蛋白會影響T細胞活化、增殖等，導致其功能出現異常。PD-1與PD-L1的結合作用被阻斷，導致PD-1功能無法發揮。在T細胞的信號傳導過程中存在某種能抑制信號傳導的病毒因素，如HCV核心蛋白的作用，使T淋巴細胞表面表達抗原分子受挫，功能被阻斷，造成持續性的病毒感染。病毒為何能夠長期在宿主器官中存在的原因可以從PD-1/PD-L1信號通路被阻斷得到部分解釋。

在一般情況下，機體外周血CD8+T淋巴細胞與CD4+T淋巴細胞占比是維持一種動態的平衡，維護機體免疫功能的基礎[13]。在過去的研究中發現，CHC患者外周血CD8+T細胞占比降低，CD4+T細胞占比升高，CD4+T細胞/CD8+T細胞比值增高，CD19+B細胞也增高，T淋巴細胞亞群細胞表面PD-1表達增強，與健康人比較，差異均有統計學意義。CHC患者免疫功能發生了紊亂，T細胞動態平衡被打破，機體無法正常有效地清除HCV感染，進而出現慢性感染[14]。CD19+B細胞占比的增高可能是因為持續性的HCV抗原刺激，使B淋巴細胞不斷的增殖，功能增強[15]。究其原因，可能是因為以下幾點：①B淋巴細胞在HCV抗原的持續刺激下會不斷地刺激免疫細胞產生IL-4、IL-6和IL-13等細胞因子，造成慢性感染；②T淋巴細胞功能被抑制，比如Th1細胞被激活，產生多余的轉化生長因子β1（TGF-β1）；③慢性化可能會因為吞噬細胞、T淋巴細胞與NK細胞間相互作用而持續發生；④通過自身抗體的產生，發生免疫級聯效應[16]。在患有B淋巴細胞缺陷的小鼠，無法產生自身抗體，而這種缺失會導致纖維化因子活性受到影響。本研究發現，高病毒載量組CD4+T細胞和CD8+T細胞表面PD-1陽性百分比顯著低于低病毒載量組，提示慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群表面PD-1的表達水平會因為血清病毒載量的不同而不同。我們推測，在丙型肝炎病毒初次感染人體后，會避開機體的免疫防御機制使人體免疫力下降而不能清除病毒，這種影響包括降低CD8+T細胞的清除病毒能力，使CD4+T細胞的免疫調節功能受到抑制，促使細胞表面PD-1表達上調，結果就是不能及時有效地清除HCV感染，造成慢性丙型肝炎持續[17]。研究發現慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA水平、血清ALT水平、血清TBIL水平與外周血T淋巴細胞亞群表面PD-1表達存在相關性，但這種關聯性不強，可能與影響因素過多有關。通過檢測血清HCV RNA水平，可以判斷HCV自我復制能力，并可通過血清ALT水平等，來綜合判斷CHC患者的肝損傷程度[18，19]。CHC患者免疫功能受損的多個方面與艾滋病患者免疫功能受損相似[20]，只是程度沒有那么嚴重。檢測外周血T淋巴細胞表面PD-1表達水平可以幫助評估患者免疫功能受損狀態，再結合對病毒復制和肝臟受損程度的評估，就可以推測患者免疫功能受影響的方方面面。