抗結核藥物所致肝損傷患者血漿MiRNA-4284水平及其臨床意義探討*

吳秀欣，張惠勇，張凱

據WHO報告，2010年全球新增活動性結核患者880萬例，死亡110萬例[1]。迄今為止，中國是全球第二大結核病負擔最重的國家，世界上約12%結核病患者生活在中國。抗結核藥物可引起肝損傷，在聯合抗結核治療期間成為最常見的不良反應之一[2]。如果沒有及時診斷或予以合適的處理措施，嚴重肝損傷患者可發展至肝功能衰竭，導致死亡[3]。藥物本身的毒性[4]及其代謝中間產物[5]被認為在抗結核藥物性肝損害（anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity，ATDH）發生發展過程中起了關鍵作用。傳統的肝損傷標志物有氨基轉移酶、堿性磷酸酶、白蛋白和前白蛋白等，而新型的標記物，如微小RNA（microRNA，miRNA）和三磷酸腺苷等也被逐步應用于臨床。ATDH的發生存在著明顯的遺傳易感性[6]。miRNA是一類長度約22個核苷酸的內源性非編碼小RNA，作為一種對基因表達的負調控因子，在基因調控中有著非常重要的作用。既往有研究發現，ATDH患者血清miRNA水平顯著升高[7，8]，而在眾多miRNA 中，miRNA-4284與肝細胞發育、脂質代謝、肝炎病毒感染、肝纖維化和肝癌發生等密切相關[9]。本研究采用高通量實時熒光定量PCR法檢測了ATDH患者血漿miRNA-4284水平，旨在探討其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月～2017年2月我院呼吸結核科收治的肺結核初治患者200例，男114例，女86例；平均年齡為（34.7±10.8）歲。肺結核診斷標準符合2001年《肺結核診斷和治療指南》[10]。納入標準：①入院行抗結核治療前肝功能正常，無血清學指標異常；②入院時無肝炎相關病史或無病毒性肝炎標志物陽性；③入院前未大量服用其它可能致肝損害的藥物和飲酒等；④不伴有其它系統器質性疾病。本研究經我院醫學倫理委員會審核同意，詳細向患者及其家屬說明實驗相關內容和研究目的，他們簽署知情同意書。

1.2 抗結核治療方法 采用 WHO推薦的標準6個月短程化學治療方案[11]，在治療過程中，均未預防性應用護肝降酶藥物。ATDH的診斷標準：在服藥過程中患者血清ALT＞2倍正常值上限（ULN），或AST和TBIL水平升高＞2倍ULN，排除乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝等可引起肝功能異常的疾病[11]。

1.3 血漿miRNA-4284檢測 采集外周靜脈血，抗凝，12000 r/m離心10 min，取上清，加入到1.5 ml離心管中，置于-80℃冰箱凍存。應用miRNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取RNA。取血漿625μL，與等體積2×Denaturing Solution混勻，室溫下再加入1.25體積無水乙醇充分混勻。把混合液加入濾筒，離心30 s，棄去濾過液。重新加入miRNA洗滌液700 μL，離心約15 s，棄去濾過液。加洗滌液500 μL，沖洗濾筒2次,每次離心1 min，以清除濾筒內殘留液體，更換收集管。95℃預熱無酶水，加入濾筒,離心30 s，收集洗脫液（含RNA），-20℃貯存。采用 Agilent Bioanalyzer 2100（Agilenttechnologies，SantaClara，CA，US） 對 總RNA行電泳質量檢測。按照 miRNAcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。 反轉錄反應體系 為 7.5μl， 即 dNTPs（100mmol/l） 0.075μl、反轉錄酶（50 u/μl） 0.5μl、10×Buffer 0.75 μl、酶抑制劑（20 u/μl） 0.1μl、去RNA酶H2O 0.075μl、特異反轉錄引物1.5μl、總RNA 4.5μl。混勻、短暫離心后，置于冰上5 min，進行反轉錄反應。在20μl PCR反應體系中，加特異性miRNA-4284 TaqMan檢測探針1μl、反轉錄產物2μl、基因表達MasterMix 10μl、去RNA酶水7μl和反轉錄得到的總RNA 5μl。反應條件為：95℃ 5 s，95℃ 1 min，3 個循環；再 96℃ 5 s，60℃ 30 s，37個循環。實驗重復3次。在對照實驗，用經0.1%DEPC處理水4.4μl代替反轉錄產物。于AB 17500實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。以U6 snRNA作為內參行溶解曲線分析，設3個復孔。在檢測結束后，得到各樣本CT值，用實驗組減去該組內參CT值，得到△CT值；將ATDH 組所得△CT值再減去非 ATDH組△CT值，得到△△CT值，最后以 2-△△CT計算出各組miRNA-4284相對水平。

1.4 統計學分析 應用SPSS 18.0統計學軟件行數據處理。計量資料呈正態分布，以x±s表示，采用兩組獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。根據miRNA-4284水平繪制受試者工作特征曲線，根據約登指數（約登指數＝敏感度+特異度-1）的最高臨界點確定血漿miRNA-4284水平診斷ATDH的最佳截斷點，計算診斷的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和正確率。

2 結果

2.1 肝損傷發生情況 在200例肺結核患者中，經過6個月抗結核治療后，發生肝功能損傷70例（35.0%），其中肝細胞型24例，膽汁淤積型20例，混合型26例。ATDH患者血清肝功能指標顯著升高（P＜0.05，表 1）。

表1 ATDH和非ATDH患者血生化指標（±s）比較

表1 ATDH和非ATDH患者血生化指標（±s）比較

與非ATDH比，①P＜0.05

例數 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） ALP（U/L）ATDH肝細胞型 24 260.9±67.9① 250.4±57.2① 20.3±9.4① 60.4±3.2①膽汁淤積型 20 39.7±9.2 40.3±2.7 33.4±10.7① 80.6±8.3①混合型 26 149.8±63.7① 141.6±55.8① 29.8±10.1① 75.4±5.2①非 ATDH 130 32.5±4.3 39.8±3.9 18.4±2.5 50.8±0.4

2.2 ATDH與非ATDH患者血漿miRNA-4284水平比較 ATDH患者血漿miRNA-4284水平顯著高于非 ATDH 患者（P＜0.05）；在 ATDH 患者中，以膽汁淤積型血漿miRNA-4284水平最低，顯著低于其他兩型（P＜0.05，表 2）。

表2 兩組血漿miRNA-4284水平（±s）比較

表2 兩組血漿miRNA-4284水平（±s）比較

與非ATDH比，①t=3.7，P=0.007

例數 miRNA-4284 ATDH 70 1.9±1.6①肝細胞型 24 2.0±1.2膽汁淤積型 20 1.7±0.7混合型 26 1.9±1.1非ATDH 130 0.9±0.6

2.3 血漿miRNA-4284診斷肺結核患者并發ATDH的效能情況 以血漿miRNA-4284水平=1.15為診斷ATDH的最佳截斷點，其曲線下面積為0.71（95%CI：0.43～1.45），診斷 ATDH 的敏感度為70.0%，特異度為69.9%，陽性預測值為77.8%，陰性預測值為67.4%，正確性為68.0%。

2.4 ATDH患者轉歸情況 在ATDH發生后，經加用護肝治療3個月，70例患者血清肝功能指標恢復至正常水平，而血漿miRNA-4284水平也降至（0.8±0.5）。

3 討論

本研究收集的200例肺結核初治患者，經常規6個月抗結核治療后，出現肝功能損害患者有70例（35%），其ATDH的發病率與既往研究報道基本一致。既往研究[12，13]認為，抗結核藥物肝臟毒性主要由于肝細胞的過敏性損傷或者中毒損傷，一般認為，2個月以內的不良反應主要是超敏反應，包括惡性、嘔吐、腹脹、納差、皮疹等，而2個月以后的臨床反應則主要考慮是毒性反應。這些藥物不良反應不僅給醫生增加了結核病治療的難度，更是給患者增加了痛苦，往往使患者中斷治療，導致耐藥產生和疾病復發。如何治療并防治肝毒性損傷，提高治療的成功率，成為了臨床工作中關鍵環節。因此，一般在接受抗結核治療的同時,需定期進行肝功能檢測，同時需密切注意患者的一般情況。當出現上述臨床/亞臨床癥狀時，應引起高度的重視。

ATDH是抗結核藥物最常見的嚴重不良反應。近二十余年來,結核病防治人員一直在致力于ATDH易感人群的研究,期望能從中尋找到某些特異性的預測因子。這項工作的重要意義顯而易見。如果在抗結核治療前對易感人群有很好的預測，那么，ATDH的發生將會減少甚至可以避免。目前,國內外學者研究較多的是藥物代謝酶基因多態性在ATDH發病中的作用,如 N-乙酰轉移酶（NAT2）[14]和細胞色素P450（CYP2E1）[15]等。既往基因組學研究[16]表明，在細胞功能與代謝酶基因的調控方面，miRNA分子起關鍵作用，而ATDH患者體內miRNA出現大量的過表達。本研究分析ATDH患者血漿miRNA-4284水平，研究結果顯示ATDH患者血漿 miRNA-4284的相對水平較非ATDH顯著升高（平均水平高2倍以上），提示miRNA-4284可能在 ATDH的發生發展過程中起了重要作用。既往研究[17]發現，miRNA-4284的功能涉及到物質代謝和轉運、線粒體能量供給、細胞形態維持、信號轉導以及炎性細胞黏附和免疫應答調控等方面。miRNA-4284的重要靶基因主要有核受體結合因子2（NRBF2）、E2F 轉錄因子、Ras 相關蛋白 2A等，其中NRBF2是基因激活蛋白，可調控PI3KⅢ 活性，誘導肝細胞自噬，并阻止內質網應激介導的細胞毒性作用和肝損傷[18]。因此，血漿miRNA-4284水平升高可能增加了肺結核患者對ATDH的易感性。

研究進一步分析miRNA-4284對ATDH的診斷價值，結果顯示，ATDH肝細胞型 和混合型患者血漿miRNA-4284水平顯著高于膽汁淤積型，差異有統計學意義（F=3.5，P=0.02）。血漿miRNA-4284水平診斷ATDH的最佳截斷點為1.15，其曲線下面積為 0.71（95%CI：0.43～1.45），診斷 ATDH 的敏感度為70.0%，特異度為69.9%，陽性預測值為77.8%，陰性預測值為67.4%，正確性為68.0%。上述結果表明血漿miRNA-4284水平在診斷ATDH方面具有一定的作用。國外一項前瞻性研究[19]表明，根據主要致病方式及臨床表現的不同將ATDH分為肝細胞型、膽汁淤積型和混合型，不同類型的ADTH所需要的治療也存在一定的差異。因此，早期區別不同ATDH類型，對于患者治療及預后均具有重要的臨床意義[20]。

近年來，雖然對于ATDH的研究涉及到各方面，但針對ATDH護肝治療的療效評估，目前尚無統一的檢測指標。本研究給予ATDH組患者3個月護肝治療后，再次檢測血漿miRNA-4284水平，結果發現患者肝功能指標恢復至正常水平，而血漿miRNA-4284水平也大幅降低。上述結果說明動態監測血漿miRNA-4284水平，對于判斷治療療效也有一定的幫助。

盡管本研究經過嚴格的試驗設計，但是尚未針對各亞型的ATDH進行進一步的研究。ATDH患者血漿miRNA-4284水平明顯升高，其在臨床診斷及療效評價等方面均有一定的應用價值，值得進一步研究。