脈絡膜新生血管相關信號通路研究進展

鄧寶娣，李 嘉，王庭槐

0引言

脈絡膜新生血管(choroid neovascularization，CNV)又稱視網膜下新生血管，是年齡相關性黃斑變性[1-2]、病理性近視[3]、中心性滲出性脈絡膜視網膜病變[4]、息肉狀脈絡膜血管病變[5]、特發性脈絡膜新生血管[6]、眼組織胞漿菌病綜合征[7]等多種眼內疾病的基本病理改變，常累及黃斑，導致中心視力的嚴重損害。隨著眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)、吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)及光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)的廣泛應用，人們認識到CNV是多種眼底病的重要病理現象[8-9]。CNV來自脈絡膜毛細血管，經Bruch膜(Bruch’s membrane，BrM)入侵視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層和Brush膜，因新生血管結構不完整，滲漏的液體積聚在RPE層和視網膜之間，使感光細胞與RPE層分離，最終導致失明[10]。目前對CNV的研究多與視網膜新生血管交叉，但是與視網膜新生血管不同，單純在RPE表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的轉基因小鼠不足以誘發CNV，需要視網膜下注射操作產生的炎癥反應才能實現[11]，且二者在病理學上也有很多不同之處。因此，進一步研究CNV的發生發展機制對其診療具有重要意義。目前研究報道的與CNV相關的信號通路主要包括5條，分別為VEGF信號通路、Wnt信號通路、Shh(sonic hedgehog)信號通路、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β/Smad信號通路和Notch信號通路。下面我們將分別闡述這5條信號通路在CNV發生發展中的研究進展。

1 VEGF信號通路

VEGF作為強大的促血管生成因子，其在各類新生血管性疾病包括各種眼底血管疾病、腫瘤、傷口愈合等過程中的作用已有大量研究，其中以VEGF-A/VEGFR-2信號通路研究最多[12]。關于CNV的研究也以VEGF-A信號通路研究為主[13]。VEGF-A與其受體結合后，可調節血管內皮細胞，促進血管生成并增加血管通透性，因此VEGF-A及其受體也是CNV治療的靶分子。經典的VEGF通路為VEGF-A與VEGFR-2相連后，形成二聚體，并激活受體激酶活性，從而催化受體自體磷酸化。磷酸化后的受體反過來可募集相關蛋白并激活多種胞內信號通路，如Y1175殘基磷酸化可誘導磷脂酶(phospholipase，PLC)γ-依賴的鈣離子動員和激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，進而激活絲裂原活化蛋白激酶通路，導致細胞持續增殖[12]。目前，玻璃體內注射抗VEGF單克隆抗體仍是治療CNV的主要方法，然而仍有高于60%的年齡相關性黃斑變性患者接受此治療后視力情況并未改善[14]，因此，在研究CNV具體發生發展機制以及研發更有效的治療方式或者藥物時，僅僅局限于VEGF信號通路是遠遠不夠的。

2經典Wnt信號通路

Wnt是一類富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，與卷曲蛋白(frizzled，Fz)受體或Fz/低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受體相關蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)共受體結合，從而調節眾多靶基因的表達。當Wnt與LRP5/6共受體結合，可保護轉錄因子β-連環蛋白(β-catenin)免受磷酸化降解，進而β-catenin在胞內蓄積，β-catenin轉位至核內從而調節包括VEGF在內的靶基因的表達。如Wnt缺失，β-catenin則會由含糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinases-3β，GSK-3β)的蛋白復合物磷酸化降解[15]。研究發現，Wnt信號通路與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)信號通路間可能存在惡性循環調節機制，加重CNV形成[16]。Wnt信號通路還可增強核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路的免疫反應，加重CNV進展[17]。在滲出型年齡相關性黃斑變性，上調Wnt信號通路可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，進而激活氧誘導因子-α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信號通路，HIF-α可激活葡萄糖轉運蛋白(glucose transport albumen，Glut)、己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A，LDH-A)、單羧酸轉運蛋白-1(monocarboxylate transporter-1，MCT-1)等糖酵解酶，引發有氧糖酵解，使視網膜內皮細胞胞內產生過多乳酸，進而激活VEGF活性，形成CNV[17]。最新一項體外人臍靜脈實驗發現，Wnt/β-catenin信號通路通過氧化應激介導了氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)引起的人臍靜脈內皮細胞損傷[18]。鑒于Wnt信號通路在CNV發生發展過程中扮演與多通路交互作用的角色，其特異性阻斷劑能否有效抑制人CNV進展甚至使已有的損傷好轉，亟需進一步的臨床試驗加以驗證。

3 Shh信號通路

哺乳動物體內含有3種Hh(hedgehog)基因：Shh、Ihh(indian hedgehog)、Dhh(desert hedgehog)[19]。其中，Shh是發育過程中一個強大的血管生成因子[19]，癌癥發生過程中表達升高[13]。Hedgehog信號通路主要由信號分子Hh、膜受體修補蛋白(patched，Ptc)、Smo(smoothened)以及某些中間信號轉導分子和核轉錄因子翅脈中斷基因(cubitus interruptus，Ci)/膠質瘤相關原癌基因同源物(glioma-associated oncogene homoglog，Gli)等組成[20]。Hedgehog信號通路為配體Shh與Ptc受體結合后，Ptc解除對Smo的抑制，Smo的C-末端進而被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)、G蛋白偶聯受體2(G protein-coupled receptor kinase 2，Gprk2)等激酶磷酸化激活，促使Smo在纖毛內聚集并打開構象，進而與埃利偉氏綜合癥基因(Ellis-van Creveld/Ellis-van Creveld-2，Evc/Evc2)結合形成Smo/Evc/Evc2復合物，驅動蛋白家族成員7(kinesin-like protein family member 7，KIF7)受Hh募集并激活此復合物，從而募集激酶磷酸化Gli蛋白，磷酸化的Gli易位到細胞核中，激活Shh靶基因[21]。最初發現Hedgehog可能與CNV相關是因為一項全基因組關聯分析發現Shh信號通路元件Gli2和Gli3與年齡相關性黃斑變性密切相關[22]。最新研究發現，Shh信號通路與年齡相關性黃斑變性中CNV密切相關，用環巴胺(cyclopamine)抑制Shh信號通路可減小激光誘導的CNV損傷，而用其激活劑purmorphamine可使新生血管面積顯著增大[19，23]，且Shh通路是通過上調下游的HIF-1α-VEGF-delta樣配體4(delta-like ligand 4，DLL4)級聯反應起作用的[23]。可見Shh信號通路在CNV形成過程中的作用同樣不容小覷，其調節HIF-1α-VEGF信號通路的具體機制還需進一步探究。

4 TGF-β/Smad信號通路

TGF-β是一種多效細胞因子，其介導的信號通路參與細胞增殖、分化、血管生成、神經元生長、炎癥、纖維化過程和免疫監測等[14]。目前發現的TGF-β有6種類型異構體，而哺乳動物中則有TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3三個亞型，其體外性質類似，但體內效應不同[24]。TGF-β有Ⅰ型和Ⅱ型兩個重要的受體[25]。成熟的TGF-β1在發揮作用時首先與TRⅡ結合，誘導其磷酸化再與TR I結合形成二聚體復合物，該復合物可使調節受體的Smads蛋白(Smad2和Smad3)磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白與結合型Smads蛋白(Smad4)結合為Smads復合物并移位至細胞核，再與其它轉錄因子共同調節靶基因的轉錄[14]。多項研究發現，在激光光凝誘導的鼠CNV模型中，TGF-β/Smad信號通路通過調節促血管生長因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、VEGF的表達在CNV的進展中發揮重要作用，而特異性TGF-β均能有效抑制CNV的形成[14，24]。然而，有學者則發現，TGF-β具備穩定脈絡膜和視網膜血管的作用，特異性阻斷其在眼內血管內皮細胞上的主要信號通路，足以誘發CNV[25]。考慮到前兩者用的TGF-β抑制劑為對TRⅠ具特異性抑制作用或對TGF-β各種亞型均具有特異性抑制作用，而后者則特異性敲除TRⅡ，我們猜想，TRⅠ在CNV的形成中起促進作用，而TRⅡ在血管正常更新中起重要作用，從而導致抑制不同的TR出現相反的作用。然而，其具體作用機制及此說法是否成立，還需進一步研究加以驗證。

5 Notch信號通路

Notch信號的傳遞可在多種過程中發揮調節作用，如血管發生、肌發生、神經生成和發生及造血等過程，并且決定不同組織中各種細胞類型的生長、分化和存活[26]。Notch信號通路的激活有兩種方式：Notch經典傳導途徑和CSL[DNA結合蛋白在哺乳動物、果蠅、線蟲的名稱分別為C-啟動子結合蛋白-1(C-promoter binding protein-1，CBF-1)、無毛抑制因子(suppressor of hairless，SuH)及Lag-1，合稱CSL]非依賴途徑，體內以經典傳導途徑為主[27]。Notch配體與其受體的細胞外結構域結合，在γ-分泌酶依賴性蛋白水解酶作用下裂解釋放Notch細胞內結構域入核，隨后Notch1與CSL結合并將其轉錄抑制因子轉化為轉錄激活物復合體，從而作用于下游靶基因[28]。近年研究發現，Notch信號在血管生成中扮演重要角色，在內皮細胞增殖、遷移、血管分化和血管形成等過程中發揮重要作用[29]。多項研究發現，Notch信號通路可負向調控病理性眼的血管生成，而減弱Notch信號通路可加重CNV帶來的損傷[27，30]。然而根據最新研究報道，敲除骨髓細胞中的Notch信號通路可抑制激光損傷后視網膜和脈絡膜中的早期炎癥反應，減少脈絡膜中Arg1陽性單核細胞在脈絡膜中的聚集，從而抑制VEGF和TNF-α的產生，進而抑制CNV的形成[26]，這一截然相反的結果，可能是由于不同的細胞類型中Notch信號通路對CNV形成與發展具有不同的作用。因此，需進一步明確Notch信號通路在CNV發生發展中的作用，有利于我們深入理解CNV中免疫反應與新生血管形成的交互作用。

6其它相關影響因子

近年來，炎癥反應在CNV發生發展中的作用引起人們的關注。有研究報道表達于CNV內皮細胞上的γ干擾素誘導蛋白(interferon-γ inducible protein 10，IP-10)/CXC趨化因子受體3(CXC chemokine receptor 3，CXCR3)信號通路具有抑制CNV的作用，其機制可能與IP-10/CXCR3信號通路影響病灶部位炎癥反應相關[31]。而最新的一項臨床試驗顯示濕性年齡相關性黃斑變性患者眼內IP-10水平明顯較白內障患者高，玻璃體腔注射阿柏西普(afibercept)后，IP-10的水平進一步升高[32]，證實了IP-10在CNV發生發展中起抗新生血管作用的假設。此外，基質金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2，MMP-2)[33-34]、Toll受體(toll-like receptors，TLRs)[35]、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)[36]等因子在CNV中的作用也有報道，闡明上述因子與CNV的關系將有助于加深我們對CNV的理解。

7展望

了解上述信號通路在其它生理病理過程中的交互作用，也能給CNV的研究帶來一定的啟發。研究表明，在大腸腫瘤中Wnt信號通路可以上調VEGF表達[37]，間質間充質細胞中的Shh信號通路可上調VEGF表達[38]，兩者均有促進VEGF信號通路的作用，且在膀胱上皮干細胞中Shh信號通路通過上調基質中Wnt信號通路誘導尿路上皮細胞和基質細胞的增殖[39]，那么在新生血管形成中，Shh信號通路是否通過上調Wnt信號通路從而調控VEGF信號通路？如是，其關鍵分子又是哪一個？另外，在自身免疫性心肌炎研究中，TGF-β可通過誘導Wnt蛋白的分泌從而激活Wnt信號通路[40]，而TGF-β介導的上皮細胞向間充質細胞轉化需要Notch信號通路的參與[41]，Notch信號通路調控血管分支形成的作用也需要有TGF-β信號通路參與[42]。另有研究報道肝嗜鉻細胞中的Wnt信號通路通過上調鋸齒狀蛋白1(jagged1b，jag1b)和鋸齒狀蛋白2(jagged2b，jag2b)表達進而調控膽管上皮細胞中Notch信號活性[43]，那么TGF-β信號通路是否可能通過Wnt信號通路正反饋Notch信號通路，抑或只是不同組織細胞間不同信號通路競爭拮抗作用？若這些信號通路間相互作用的分子機制得以闡明，將有助于我們進一步加深對CNV及其它新生血管性疾病發病機制的認識。

綜上所述，CNV的形成是多條信號通路包括促血管生成因子、抑制血管生成因子及炎癥因子等共同作用的結果，因此在CNV機制的研究過程中，不應只考慮促進新生血管形成的相關信號通路，而應考慮到其它一些信號通路的參與，如抑制新生血管的信號通路及免疫相關信號通路等，這些通路交互聯系的作用同樣在CNV的發生發展過程中具有重要作用，從而拓寬我們對CNV的認識。然而，目前大多數關于CNV治療方案的研究多數是在改進抗VEGF治療的給藥方式或者研發新型抗VEGF藥物[44-45]，各通路在CNV的具體作用尚未明確。在以后的研究中仍需要進一步闡明這些信號通路在CNV發生發展過程中的具體作用，從而為研制治療CNV相關性疾病長期有效的防治方式提供思路。