視網膜類器官治療視網膜退行性疾病的研究進展

奚惠雨，茅希穎，孫 潔，袁松濤，劉慶淮

0引言

眼睛，作為連接人類與外在世界的窗戶，給予人類分辨外界事物以及顏色的能力。其中視網膜作為整合視覺信息的復雜神經組織結構，它的損傷往往會導致視力不可逆的損害。在大多數國家，視網膜退行性病變是導致視網膜細胞損傷的重要原因[1]，如視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等[2]，這些疾病會導致感光細胞功能損傷及數量減少，引起視力受損，最終導致失明。目前此類疾病的治療方法包括神經保護治療、基因療法、藥物療法、光遺傳學治療、人工視網膜以及細胞替代療法等[3]。但是，大多數治療方法包括已進入臨床試驗的視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cells，RPE)移植的治療目標均為保護殘存的感光細胞，因此只適用于疾病的早期階段。但針對感光細胞大部分丟失的疾病晚期階段，迄今為止仍未建立有效的治療方案。如何獲得移植所需的感光細胞并進行有效移植，是治療晚期視網膜退行性疾病的關鍵問題。本文通過介紹感光細胞移植的發展及體外獲得大量人源性感光細胞的方法，總結外源性感光細胞及視網膜組織用于移植治療的主要方法及局限性，以期為視網膜退行性疾病的感光細胞移植治療提供新思路。

1感光細胞移植替代治療的發展

在過去的30余年，視網膜退行性疾病動物模型的感光細胞移植替代療法的有效性已得到不斷證實。最早期的感光細胞移植替代研究主要是小鼠體內來源的感光細胞移植整合效率的研究，包括分別將新生鼠視網膜全層細胞、感光細胞層以及感光細胞懸液移植至視網膜下腔中。20世紀90年代，Gouras等[4]和Kwan等[5]分別報道了分離新生鼠的感光細胞懸液并移植至內源性感光細胞幾乎完全消失的視網膜變性鼠模型中。這些研究發現移植的感光細胞有新生的外節段且能與內核層細胞形成突觸連接，并證實變性的感光細胞被移植的新細胞替代后，內在的神經視網膜可以重新形成視覺信息[6]。有研究將不同發育階段的小鼠視桿細胞移植進正常及疾病小鼠模型中，發現出生后4～6d來源的視桿前體細胞具有最強的整合能力[7]，而將出生之前的視網膜祖細胞(retinal progenitor cells，RPCs)進行移植發現其在體內出現不可控的分化方向，表現為僅有小部分分化為感光細胞。因此，具備最佳移植狀態的感光細胞應為小鼠出生后4～6d的細胞，因為這個時間點感光細胞剛剛能夠產生突觸連接。除了細胞懸液移植外，視網膜全層細胞及感光細胞層的移植也得到了不斷研究[8-9]。如將胎鼠細胞層移植進入視網膜下腔發現其向RPE層形成外節段，并且能夠幫助維持光誘發活動，另有研究將胎兒視網膜層移植于重度ARMD與RP患者中，發現視覺功能及視力均得到有效改善[10-11]。

盡管體內來源的細胞研究證明了感光細胞移植的可行性，但由于人供體細胞通常來源于2～3月齡胎兒，并且存在倫理及細胞來源不足等問題，因此體外獲得大量可供移植的細胞成為臨床應用的必要前提，而干細胞體外分化技術產生的細胞資源為感光細胞的移植創造了條件。

2視網膜體外培養技術的研究

人胚胎干細胞(hESC)[12]和人誘導多能干細胞(hiPSC)[13]是一類可在體外大量擴增并具有分化為三胚層中的不同組織細胞潛能的重要細胞。在過去的10a中，隨著干細胞研究的逐漸深入，眾多實驗室在體外將干細胞逐步分化出胚胎發育過程中形成的早期神經組織、眼區、RPCs等，最終分化產生多種細胞類型[14-15]。在最初的2D培養中，對由hESC形成的胚體添加Wnt/BMP通路抑制劑等，多數細胞向神經視網膜方向分化[16-18]，并通過添加Notch通路抑制劑產生感光細胞。然而，分化產生的這些細胞大多數為內層視網膜細胞，且幾乎沒有細胞表達成熟感光細胞標志物，如opsins。因此，在后續培養中，通過補充加入對早期感光細胞發育有促進作用的視黃酸與牛磺酸以提高表達有opsins的感光細胞數量[19-20]。盡管已證實將2D培養產生的感光細胞移植到疾病鼠中可恢復部分視覺功能[21]，但2D培養所產生的感光細胞仍缺少分化成熟的能力，尤其是無法形成感光細胞外節這一重要結構。其次，2D培養分化產生的視錐和視桿細胞的數量及比例與體內分化相比仍有很大不同[22]。此外，無論是在2D貼壁培養組織或類胚體(embroynics bodys，EBs)中，都沒有正常的視網膜上皮細胞層結構，這也會影響感光細胞的正常發育。

為解決上述問題，2011年Sasai和David課題組提出了體外3D視網膜分化的方法。使干細胞在體外自發形成符合體內發育規律，具有生理結構的視網膜類器官(organoid)[23-24]。不同實驗室也對類器官分化方法進行了優化。其中，Zhong等[25]解決了感光細胞分化的一個重要問題即體外感光細胞能夠成熟并形成外節結構，并證實小部分感光細胞存在光反應，且不斷有實驗室報道在體外分化的感光細胞有纖毛結構以及早期外節的產生[26-28]。因此可以證明，與2D培養相比，3D體外培養已能夠分化出視杯細胞及形成視網膜分層，并且隨著類器官培養時間至數月時，可以產生多種細胞類型，包括感光細胞前體細胞以及包含外節的成熟感光細胞。這對干性ARMD等視網膜退行性疾病中進行性萎縮退化的RPE、神經視網膜以及脈絡膜血管的替代治療都十分重要。因此，3D體外培養技術作為目前主要的細胞來源手段，對臨床尤其是移植替代治療的應用有著十分重要的意義。

此外，隨著體細胞重編程技術與基因編輯技術不斷發展，我們可以將遺傳性視網膜退行性病變患者的成體細胞重編程形成iPSC，使之不僅能夠產生重要的臨床研究模型，并能分化為視網膜類器官用于藥物篩選，并為感光細胞的移植治療提供有效的資源[29]。其中，CRISPR/Cas9基因編輯技術在內在基因缺陷的修復方面發揮重要作用[30]，使患者的iPSC能夠成為重要的自體移植細胞來源。且最近研究發現，RNP CRISPR/Cas9技術能夠更高效地進行基因的編輯并且脫靶效應更低，在臨床應用中更有意義[31]。因此，與hESC來源的類器官移植相比，自體來源的iPSC分化形成類器官在移植替代治療中最大的優勢是減少了移植后的免疫原性。盡管目前這種方法成本非常高，但有研究發現主要組織相容性復合體匹配的患者在使用相同的iPSC后，會大大降低移植的成本與分化的可變性[32]。因此，基因編輯后的類器官的產生能夠有助于了解視網膜退行性疾病的發病與轉歸機制，從而為治療提供新的思路。

3視網膜類器官在移植替代治療中的方法研究

3.1視網膜類器官的片層移植視網膜發育至胚胎期8～14wk時大量產生感光細胞前體細胞并且出現RPCs增殖以及其它神經細胞，既往研究通常使用這一時期的視網膜組織進行移植[33]。已經證實，視網膜類器官在體外30～70d與體內胚胎期8～14wk發育過程相同，可替代胎兒視網膜片層進行移植研究，并且移植進的視網膜類器官片層組織的分化成熟與整合也得到了不斷證實。有研究將不同分化階段的小鼠類器官分割成小片層，并移植進入感光細胞完全缺失的小鼠視網膜下腔中，發現各個時期的移植組織都不斷分化并產生外核層，且移植片層會在宿主體內形成3種形態，11～17d相對不成熟的移植片層可與宿主形成最佳的突觸連接，且移植物中外核層伴有較少的內核層可更好地與宿主內核層接觸[34]。雖然在上述研究中可以看到突觸的連接和整合，但移植片層的功能并沒有得到證實。此外，也有研究將人50～60d視網膜類器官片層移植到裸鼠以及外核層退化的靈長類動物模型中，可以看到臨近宿主內核層有玫瑰花結樣組織形成，且表達有成熟的感光細胞標志物并出現成熟的外節。在靈長類動物模型中，可觀察到片層中的感光細胞與片層和宿主的雙極細胞之間均存在突觸蛋白表達，但未能檢測到局部電信號的產生[35-36]。盡管如此，這也證實了hESC來源的類器官不僅可以形成成熟的感光細胞，也能與宿主視網膜形成突觸連接，這為臨床應用提供了強有力的理論依據。

上述研究表明通過移植完整或解離的視網膜類器官片層能夠治療感光細胞退行性疾病，但由于移植的片層細胞組成復雜，結構紊亂，移植替代效果目前也并不十分理想。因此，類器官片層移植的應用仍需要不斷地探索和優化。

3.2視網膜類器官的單純感光細胞移植體內來源的小鼠感光細胞懸液移植研究證明感光細胞前體細胞能夠功能性地整合于退化的視網膜中，故在人類視網膜移植替代的研究中，從類器官中獲得最佳且單純的感光細胞十分重要。有研究將綠色熒光蛋白(GFP)報告基因敲入干細胞系并進行分化，通過流式技術分選帶有熒光的細胞，利用此方法將小鼠類器官的Rhop.GFP+的視桿細胞分離出，并注射至視桿細胞缺乏的Gnat1-/-鼠的視網膜下腔中，結果表明感光細胞前體細胞階段的移植更有整合效率，并且移植細胞與宿主細胞產生電生理現象且有感光細胞外節形成。此外，整合進的細胞與宿主細胞有著類似的藥理學激動劑和拮抗劑反應，證明體外衍生的細胞與天然細胞具有相似性[37]。但在臨床應用中無法使用GFP+的感光細胞進行移植，因此另一種直接獲得單純感光細胞的方法是通過感光細胞表面標志物進行流式技術分選，如CD73+、CD133+、CD24+、CD15-等。最近的一項研究發現，與鼠類器官分選不同的是單獨的CD73+無法對人來源的視網膜類器官進行有效分選，有研究者發現CD29/SSEA-1雙陰性結合或者不結合CD73+的分選方式雖然產出的細胞總量較低，但可以獲得更大比例的感光細胞[38]。

盡管人來源的視網膜類器官可以為移植替代治療提供豐富的細胞資源，但目前人源性類器官的單純感光細胞移植的效果還未得到更多證實。這可能與感光細胞表面標志物特異性差，GFP敲入細胞系難構建以及分化出的視錐細胞比例低有關。因此，如何有效地在早期獲得成熟的、大量的可供移植的感光細胞仍是目前需要解決的問題。

4視網膜類器官的優勢與局限

目前，以干細胞為基礎的視網膜體外分化技術涵蓋了視網膜發育過程中的細胞與分子層面上的主要特征[39]。類器官的應用不僅在于能為視網膜退行性疾病的細胞移植治療提供豐富的組織資源，且與其它技術的結合與利用也能夠幫助了解視網膜正常發育以及變性過程，建立疾病模型，測試藥物治療功效等[40-41]。而且疾病應用模型與藥物測試相結合也為精準醫療帶來了可能性，如誘導復雜遺傳性疾病的患者iPSC分化產生特異的類器官以定制個性化治療方案等。

但是，視網膜類器官在分化與移植方面仍存在問題：(1)盡管不同實驗室對3D培養技術下由干細胞分化為視網膜類器官進行了不斷優化，但目前的培養技術仍有一定的局限性。如在長期培養中獲得的已經分化成熟的類器官的結構仍有很高的變異性，從而影響數據信息的穩定[42]，因此通過改進現行的3D培養技術以提高長期培養中類器官的穩定性顯得尤為重要。(2)雖然在類器官中能夠發現雙極細胞、水平細胞和Müller膠質細胞等細胞的標志物，但正確的視網膜細胞類型比例仍未形成，尤其是位于內核層中的細胞。(3)由于視網膜類器官與胎兒體內視網膜分化的時間大致相同，即體外視網膜分化成熟與獲得通常所需數月時間，這也大大增加了視網膜疾病治療以及獲得移植資源的時間。因此，有效縮短培養獲得類器官的時間也是十分必要的，但分化時間的縮短有可能會引起細胞分化命運的改變。(4)盡管已經有研究將干細胞分化產生的視錐細胞移植進晚期階段的RP模型中證明了視錐細胞移植的可行性[43]，且有研究分別對胎兒及干細胞來源的視錐細胞的轉錄譜進行了分析[44]，但目前的視網膜類器官仍無法產生與分離大量人類高敏視力所需要的視錐細胞，尤其是L/M型視錐細胞。因此，視錐細胞定向分化以及純化的方法仍需要進一步研究。

5展望

目前，為解決分化中的問題，3D培養方法已在不斷改進，已經發現缺氧和生物反應器的使用能促進感光細胞的產生[45]，但臨床試驗的應用仍需要3D分化方法的進一步優化，以維持類器官功能的穩定和量化分析產生的感光細胞的純度、活力及發育階段。再者，移植細胞的安全性仍然需要得到有效評估，因為未分化的干細胞及有增殖能力的細胞群會導致腫瘤組織的形成[46]。因此，在移植前有效地移除這些細胞，不僅能夠減少腫瘤發生的風險，更重要的是能提高感光細胞的整合效率。此外，已經發現移植進的感光細胞與宿主細胞之間可以發生蛋白質與核糖核酸(RNA)的物質交換[47]，但與直接的物理整合不同的是，移植細胞與宿主細胞間的“物質交換”，可以看作是在功能上更新受損的神經元。因為這種交換首先需要宿主中仍有殘存的感光細胞，其次移植細胞仍然依賴宿主細胞的突觸連接，因此這種交換并不是功能上的整合。盡管目前細胞之間的物質交換機制仍不清楚，但是可以猜想移植細胞的整合現象不僅僅是與宿主細胞的物理整合有關，也許與這種物質交換也有關[48]，因此感光細胞移植治療的機制仍有待于進一步研究。此外，這種靶向性地細胞間的融合可能產生一種新的治療方式，例如可將體內Müller膠質細胞重編程產生感光細胞前體細胞，進而分化為感光細胞，這可能會對現有移植方法提供新的啟示。

總之，人類體外視網膜3D培養產生類器官作為一種新興且快速發展的技術，不僅為臨床移植替代治療的應用提供了新的思路與前景，也充滿著許多未知的挑戰與可能。而這些問題與挑戰的不斷解決，為視網膜退行性疾病的治療提供了光明的前景。