耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥機制及檢測方法研究進展*

李雪寒 綜述，李一榮 審校

(武漢大學中南醫院檢驗科，湖北武漢 430071)

金黃色葡萄球菌常定植于皮膚和鼻腔，致病能力強，能導致皮膚軟組織感染、中耳炎、心內膜炎及菌血癥等多種感染。20世紀40年代初期，青霉素G應用于臨床后顯著改善了金黃色葡萄球菌感染的治療療效。但是，1942年，臨床上就發現了耐青霉素G的金黃色葡萄球菌。1959年，為治療耐青霉素G的金黃色葡萄球菌感染，臨床上引入了甲氧西林，一種半合成的耐青霉素酶的β-內酰胺類抗菌藥物，它對產青霉素酶金黃色葡萄球菌有良好的殺傷作用。1961年，JEVONS在英國首次證實了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在，此后，臨床上MRSA菌株的檢出率逐年增長。到1985年，MRSA開始出現暴發性流行，成為全球院內感染的首要病原體。在2011年，僅在美國一個國家，MRSA就造成了超過8萬例的侵襲性感染[1]。MRSA感染的高發生率和死亡率已經導致巨大的社會和經濟損失?，F就MRSA的流行狀況、耐藥機制和檢測方法等研究進展做一綜述。

1 MRSA的流行狀況

自1961年首株MRSA發現以來，臨床上MRSA的檢出率逐年升高，到20世紀80年代后期，MRSA已成為全球發生率最高的院內感染病原菌之一。在印度，1999年MRSA的檢出率已達80.8%，到2004-2006年，更是增長到了86.5%[2]。在歐洲的羅馬尼亞，2015年，MRSA的檢出率達到57.2%[3]。還有一些地區，MRSA的檢出率雖然不高但呈持續增長趨勢。例如澳大利亞，MRSA的檢出率由2000年的12.0%上升到2013年的19.0%。在歐洲的塞浦洛斯和斯洛伐克，MRSA的檢出率從2012年的35.2%和21.7%分別上升到了2015年的43.4%和28.1%[4]。在我國，從2005年中國細菌耐藥性監測開始以來，在檢出的革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌所占比例一直都是第1位，在33.0%左右波動，而MRSA又是耐藥性金黃色葡萄球菌中最常見的。雖然自2005年以來，我國的MRSA檢出率處于下降趨勢，但局部區域的MRSA檢出率依然在70.0%以上[5]。

20世紀90年代以來，MRSA 所致感染的流行病學發生了顯著的變化，不僅局限于醫院內，而且呈現出向院外蔓延的趨勢，于是提出了MRSA的兩種分型，即醫院獲得性MRSA(HA-MRSA)和社區獲得性MRSA(CA-MRSA)。HA-MRSA通常引起住院、免疫力低下或老年患者的感染，這類人群一般是有手術史、經常接觸醫院衛生設施以及接受抗菌藥物治療的患者。而CA-MRSA則在社區間相互傳播，傾向于感染健康的年輕人，這些人在發病前與醫療機構無任何接觸。美國德克薩斯州的研究表明,大約70.0%的社區獲得性金黃色葡萄球菌的感染均是CA-MRSA[6]。此外，CA-MRSA也可以引起醫院感染的暴發，這可能是由于CA-MRSA可以產生殺白細胞素(PVL)造成的[7]。細菌和患者在社區和醫院間不斷流動,相互傳播,導致了復雜的MRSA流行狀況。

2 MRSA的耐藥機制

2.1葡萄球菌染色體mec基因盒元件(SCCmec)的基本結構和功能 金黃色葡萄球菌通常是通過獲得SCCmec而產生對甲氧西林的耐藥性。SCCmec為可移動遺傳元件，能在葡萄球菌屬內菌株間轉移。SCCmec的大小為21～67 kb，具有高度多態性。目前，世界范圍內共發現11 種 SCCmec(Ⅰ～Ⅺ型)。雖然不同類型的SCCmec的大小和基因組成有所差異，但仍具有以下共同特征[1]：(1)攜帶一個mec基因復合體，由mec基因及其調控系統組成,與MRSA耐藥相關的mec基因為mecA和mecC。(2)攜帶一個ccr基因復合體，由位于復合體中央的ccr基因和相鄰的7～8個開放閱讀框(ORFs)組成，其中ccr基因包括ccrA、ccrB和ccrC[8]。ccr編碼的重組酶ccrAB或ccrC具有位點特異性，能識別相對應的SCCmec元件，使之從葡萄球菌染色體中精確地分離，并通過轉移整合到其他葡萄球菌的菌株中，從而實現SCCmec在葡萄球菌屬內菌株間轉移[9]。如ccrB結合attB和attS序列能完成SCCmec的剪切或整合，而ccrA盡管不直接參與SCCmec的剪切或整合，但起到促進ccrB對序列的識別作用，因而ccrA和ccrB總是成對出現。而ccrC單獨出現即可完成SCCmec的剪切或整合[1]。(3)SCCmec在orfX基因(編碼rRNA甲基轉移酶)3′端的attB序列處整合入金黃色葡萄球菌染色體組，且SCCmec的插入對orfX的表達沒有影響。此外，SCCmec元件還含有3個J區域，主要起連接作用，也可能攜帶一些其他的抗菌藥物耐藥決定簇，如轉座子Tn554(編碼對紅霉素的耐藥)、質粒pT181(編碼對四環素的耐藥)、質粒pUB110(編碼對氨基糖苷類的耐藥)等基因元件。J區域的結構差異性是SCCmec分型的依據[10]。

2.2mecA基因介導的耐藥機制 mecA大小為2 129 bp,位于Ⅰ～Ⅹ型SCCmec上，編碼一種新的青霉素結合蛋白PBP2a。PBP2a與β-內酰胺類抗菌藥物的親和力很低。因此，PBP2a不受β-內酰胺類抗菌藥物的影響，繼續發揮細胞壁黏肽合成酶的功能，催化細胞壁的合成，從而導致MRSA的產生[11]。mecA的表達受其相鄰的mecR1-mecI系統的調控，這個系統與金黃色葡萄球菌中調控β-內酰胺酶表達的blaR1-blaI系統同源。mecR1編碼感受器蛋白MecR1，mecI編碼與MecR1相耦聯的抑制蛋白MecI。MecR1是一種金屬內肽酶原，能通過胞外的青霉素結合區域感受到β-內酰胺類抗菌藥物的存在。當β-內酰胺類抗菌藥物結合到MecR1的感受器結構域,MecR1被激活,其構象發生改變，誘導胞內感受器區域自動裂解，直接或間接導致MecI分裂，從而阻礙MecI結合到mecA啟動子區域,去除MecI對mecA的抑制作用,mecA開始表達,生成大量的PBP2a,使細菌產生耐藥性[1]。

2.3mecC基因介導的耐藥機制 2007年，在一項關于奶牛乳腺炎的研究中發現了金黃色葡萄球菌菌株LGA251，它具有MRSA的表型，對苯唑西林和頭孢西丁耐藥，但是對mecA和PBP2a進行驗證時卻反復顯示為陰性。隨后對其作全基因組測序顯示，LGA251菌株攜帶一種新型的mecA同源基因，起初命名為mecALGA251，于2012年更名為mecC[12]。在此之后，在瑞典[13]、西班牙[14]、斯洛文尼亞[15]等地相繼發現mecC。mecC大小為2 198 bp，位于Ⅺ型SCCmec上，其核苷酸序列與mecA的同源性為69%。BALLHAUSEN等[16]用mecC敲除菌株(W44646ΔmecC)進行實驗，發現該菌株對頭孢西丁的最小抑菌濃度(MIC)值由16.00 μg/mL下降到4.00 μg/mL，對苯唑西林的MIC值由8.00 μg/mL下降到0.25 μg/mL。將敲除的mecC恢復后，菌株恢復對頭孢西丁和苯唑西林的耐藥性(MIC值上升為64.00 μg/mL)，從而證明了mecC與MRSA的形成有關。該研究還對mecA和mecC進行了對比研究，發現mecA和mecC的啟動子和操縱子的核苷酸序列也有所不同。mecA啟動子-10區域的序列為TAT ACT，而mecC該處序列為TAT TAT，該差異可能是導致mecA啟動子的活性在轉錄水平上高于mecC啟動子的原因。在MecI的結合位點處，mecA操縱子上包含一個30 bp的回文序列，由2個緊密相連的15 bp序列組成。而mecC操縱子上的回文結構則被一個8 bp的連接肽分為兩段14 bp的序列。這些差異表明，mecC的轉錄調控系統與mecA的存在差異。mecC的調控元件為mecISCCmecⅪ和mecR1SCCmecⅪ，分別編碼mecC轉錄抑制蛋白和感受器蛋白。其編碼的蛋白與MecI和MecR1同源性分別為66%和45%[16]。與mecA類似，mecC也編碼一種青霉素結合蛋白，稱為PBP2c。PBP2c與mecA編碼的PBP2a同源性為63%。KIM等[17]對PBP2c的性質進行研究，發現PBP2c具有藥物偏好性，相對頭孢西丁而言，其對苯唑西林的親和力更高，其對苯唑西林的親和力是PBP2a的4倍，因此表現為對頭孢西丁的高度耐藥，對苯唑西林處于中介耐藥甚至是敏感水平，而PBP2a則沒有這種現象。此外，兩者在熱穩定性方面也表現出了差異，在37 ℃時PBP2a的活性最高且穩定，而PBP2c則在25 ℃時表現出穩定的高活性。

2.4fem基因介導的耐藥機制 除mecA、mecC之外，金黃色葡萄球菌染色體上還有一些基因也參與MRSA耐藥性的產生。這些基因一般與肽聚糖的合成、細胞的分裂和細胞壁的代謝相關。fem就是一種獨立于mecA和mecC的基因。與mecA和mecC不同，fem既存在于耐藥菌中，也存在于敏感菌中。敏感菌中的fem基因被滅活，可使菌株對β-內酰胺類抗菌藥物敏感性提高。目前，已被確定的fem有6種：femA、femB、femC、femD、femE和femF。如femA和femB分別編碼FemA和FemB兩種胞質蛋白，分別添加第2個和第3個甘氨酸殘基以及第4個和第5個甘氨酸殘基到細胞壁上的五甘氨酸肽間橋，從而參與細胞壁五甘氨酸肽間橋的形成。當femA和femB失活時,五甘氨酸肽間橋被單甘氨酸取代,使細胞壁肽聚糖成分發生改變，細菌對甲氧西林耐藥性降低[18]。femC是谷氨酰胺合成酶抑制因子，當femC失活時，谷氨酰胺合成酶基因(glnA)的轉錄減少,主干肽鏈的D-谷氨酸的酰胺化減少，從而使谷氨酰胺生成減少,使細菌細胞壁的正常結構遭到破壞，細菌對甲氧西林的耐藥性降低。 femD編碼磷酸葡萄糖胺變位酶，催化葡萄糖-6-磷酸與葡萄糖-1-磷酸的相互轉化，femD失活會影響肽聚糖前體物質的合成，使細菌對甲氧西林的耐藥性降低[19]。

3 MRSA的檢測方法

快速精準地檢測MRSA對臨床抗感染治療具有重要的作用。MRSA檢測方法較多，主要包括MRSA表型檢測(苯唑西林以及頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂篩選法、膠乳凝集法檢測PBP2a、顯色培養基法等)和MRSA耐藥基因檢測。2008年，美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)將頭孢西丁紙片擴散法列為MRSA的推薦檢測方法。2011年，DATTA等[20]比較了5種MRSA表型檢測方法的性能，證明頭孢西丁紙片擴散法為一種非常好的MRSA表型檢測方法，但他們認為還需要使用其他的方法作為補充來提高檢測的靈敏度。實驗數據顯示，乳膠凝集法的靈敏度為100.0%，特異度為99.2%，因此,推薦使用頭孢西丁紙片擴散法與乳膠凝集法聯合檢測。之后，FARAHANI等[21]也通過實驗證明了頭孢西丁紙片擴散法是臨床首選的MRSA檢測方法。PCR法檢測mecA基因一直以來被認為是檢測MRSA的“金標準”。KOUPAHI等[22]對比了PCR法和4種表型檢測方法，結果顯示，頭孢西丁紙片擴散法和PCR法的靈敏度和特異度均為100.0%，苯唑西林紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法和顯色培養基法的靈敏度分別為95.45%、97.22%和98.13%，并認為頭孢西丁紙片擴散法可以在沒有分子檢測設備的情況下作為“金標準”的替代方法用于檢測MRSA。

臨床上對于MRSA的檢測主要是根據MRSA對苯唑西林和頭孢西丁高度耐藥的表型以及通過驗證mecA和PBP2a來判定的。但是，對于mecC MRSA，由于其對頭孢西丁高度耐藥而對苯唑西林敏感的表型以及mecA和PBP2a陰性，可能會將其誤判為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)。因此，在進行檢測時，選用頭孢西丁進行藥敏試驗比苯唑西林對mecC MRSA的檢測結果更準確[23]。當然，僅根據藥敏試驗結果檢測mecC MRSA是不夠可靠的。與傳統MRSA的檢測相似，應用PCR技術驗證mecC是檢測mecC MRSA的“金標準”。STEGGER等[24]應用多重PCR技術對185株金黃色葡萄球菌同時進行mecA和mecC的檢測，結果顯示靈敏度和特異度均為100%。此外，該項技術還能同時檢測PVL毒力基因和進行spa分型。PICHON等[25]應用四重實時PCR技術同時檢測mecA、mecC、PVL毒力基因和nuc，此項技術不僅能精確檢測出4種基因，并且能將檢測時間縮短到1 h以內，這為臨床上檢測MRSA提供了更為快速且全面的方法。BECKER等[26]利用Xpert MRSA Gen 3系統聯合PCR技術同時檢測mecA、mecC和SCCmec-orfX連接區域，這項技術大大增加了MRSA檢測的特異度。SEIDEL等[27]將核酸側流免疫分析(NALFIA)技術與PCR技術相結合用于檢測mecA和mecC基因來檢測MRSA。相對于普通PCR和實時PCR技術來說，PCR D核酸橫向流動免疫檢測技術有更精密的檢測限度，并可以區分mec的不同等位基因，且耗時較短，這使MRSA的檢測向著更精準快速的方向邁進。

4 總 結

MRSA被世界衛生組織列入了2017年“重點致病菌”名單，其所造成的感染在今后相當長時間內依然是棘手的全球公共衛生問題。臨床微生物室通常使用紙片擴散法或顯色培養法來鑒定MRSA，但是由于mecA和mecC的基因序列與調控序列均存在一定差異，金黃色葡萄球菌體內mecA和mecC表達的PBP2a和PBP2c結合β-內酰胺類抗菌藥物的能力不同，從而呈現不同的耐藥表型。mecA介導的耐藥表型已引起高度關注，但mecC介導的耐藥表型(頭孢西丁耐藥/苯唑西林敏感或輕度耐藥)易被忽視甚至誤認為甲氧西林敏感，從而導致治療失敗。因此，了解MRSA的耐藥機制及其檢測方法，特別是mecC基因介導的耐藥機制及相應的檢測方法，對于指導臨床抗感染治療具有重要意義。