乙型肝炎病毒逆轉錄酶區多位點預存耐藥變異研究*

余 蘭，黃麗雯，龔 亮，楊 菁，彭云娟

(福建醫科大學附屬寧德市醫院檢驗科，福建寧德 352100)

核苷(酸)類似物(NAs)是臨床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物，通過靶向抑制HBV逆轉錄酶的活性發揮抗病毒作用。HBV在復制過程中，由于其高復制率及逆轉錄酶校對功能的缺乏，具有高度的變異性。在宿主的選擇壓力下，可形成一個或幾個優勢突變株，即準種。長期應用NAs時，對藥物壓力適應性強的突變株成為優勢群，從而對NAs產生耐藥性，導致治療失敗。然而近期越來越多的研究表明，在未經NAs治療的慢性乙型肝炎(CHB)患者中，就存在耐藥位點突變，即預存耐藥變異。預存耐藥變異與NAs治療中的原發無應答、應答不佳或部分病毒學應答密切相關[1-2]，引起了臨床的高度關注。本研究采用基因芯片法，對未經NAs治療的CHB患者及慢性HBV攜帶者進行多位點耐藥突變檢測，并分析預存耐藥變異與患者年齡、性別、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、HBV-DNA載量之間的關系。旨在明確寧德地區HBV預存耐藥變異情況，為臨床制訂個體化抗病毒治療方案提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2014-2015年收治的CHB患者及慢性HBV攜帶者401例為研究對象。其中男247例，女154例，平均年齡34.79歲。納入標準：(1)HBV-DNA≥104IU/mL；(2)從未使用過NAs治療或用藥史不明確；(3)診斷均符合2015年中華醫學會肝病學分會、感染病學分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[3]。排除標準：(1)肝硬化及肝癌患者；(2)有嚴重基礎疾?。?3)有遺傳性或代謝性疾病史；(4)合并甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者。

1.2方法

1.2.1生化檢測 采用羅氏cobas c501生化儀及羅氏診斷試劑檢測患者ALT等生化指標。

1.2.2HBV血清標志物檢測 采用CHEMCLIN1500全自動化學發光免疫分析儀，試劑購自博陽生物科技公司，檢測血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。

1.2.3HBV-DNA定量檢測 運用實時熒光定量PCR技術進行檢測，試劑盒購自達安基因股份有限公司，檢測儀器為ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀。

1.2.4HBV多位點耐藥突變檢測 采用珠海賽樂奇生物技術有限公司提供的HBV耐藥突變位點檢測試劑盒及基因芯片檢測平臺，運用基因芯片技術進行HBV多位點耐藥突變檢測。其檢測原理為使用PCR技術擴增HBV的特定基因片段，再與芯片上特異性核酸探針雜交以檢測特定的基因位點的突變，通過生物信號原位放大技術，使基因芯片雜交信號放大到肉眼判讀的水平，檢測逆轉錄酶區rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250等8個突變位點，涉及拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替比夫定(LDT)、替諾福韋(TDF) 以及恩曲他濱(FTC)6種臨床上常用的NAs。

2 結 果

2.1耐藥位點突變情況 本研究對逆轉錄酶區rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G、rtA194T、rtS202G、rtM204V/I、rtN236T、rtM250V 8個主要耐藥位點檢測，突變位點主要集中在rtN236T、rtM204I、rtL180M 3個位點，突變率分別為15.96%、6.98%、5.24%。rtM204I較rtM204V更為常見,rtN236T的突變率高于rtM204V/I。各位點突變情況見表1。

表1 耐藥位點突變情況

表2 預存耐藥變異模式

2.2預存耐藥變異模式 401例患者中，檢出預存耐藥變異79例，耐藥率為19.70%，其中單個位點突變48例，多個位點突變31例，前3位的突變模式為rtN236T、rtN236T+rtM204I+rtM204V、rtN236T+rtM204I，其突變率分別為9.98%、2.24%、1.25%。具體預存耐藥變異模式見表2。

2.3常用藥物的預存耐藥變異情況 本研究針對6種臨床上常用的抗病毒藥物進行預存耐藥變異研究，包括L-核苷(酸)類似物(LAM、LDT)，無環核苷(酸)類似物(ADV、TDF)，脫氧鳥苷類似物(ETV)，胞嘧啶核苷類似物(FTC)等。預存耐藥變異檢出率從高到低分別為ADV(15.96%)、LAM(7.48%)、FTC(7.48%)、LDT(6.98%)、TDF(0.50%)、ETV(0.25%)。具體變異情況見表3。

表3 藥物的預存耐藥變異情況

2.4預存耐藥變異與患者年齡、性別的關系 本研究共納入患者401例，年齡2～81歲，年齡中位數為31歲。其中男247例，女154例，具體見表4、5。本研究中，年齡較小及較大組別突變率更高，女性突變率高于男性。對突變組和未突變組的年齡、性別進行χ2檢驗，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 預存耐藥變異與患者年齡的關系

表5 預存耐藥變異與患者性別的關系

2.5預存耐藥變異與患者ALT、AST之間的關系 根據《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》[3]建議，以ALT、AST的正常上限(ULN)為參考，肝酶升高程度可分為<1 ULN、1～2 ULN、>2～10 ULN以及>10 ULN。對突變組和未突變組的肝酶升高情況進行χ2檢驗，ALT、AST差異均無統計學意義(P>0.05)。在>10 ULN組別中，耐藥突變率較高，突變率隨肝酶升高呈上升趨勢。見表6、7和圖1。

表6 預存耐藥變異與患者ALT之間的關系

注：ULN=40 U/L

表7 預存耐藥變異與患者AST之間的關系

注：ULN=35 U/L

圖1 預存耐藥變異率與肝酶的關系

2.6預存耐藥變異與患者HBeAg陽性率、HBV-DNA載量之間的關系 由于耐藥檢測試劑盒對HBV-DNA載量有最低限要求，故本研究中HBV-DNA的納入標準為≥104IU/mL，以103為級差，將病毒載量分為低、中、高3個級別，病毒載量高的組別突變率較高，對耐藥突變情況進行χ2檢驗，兩組之間的差異無統計學意義(χ2=4.41，P>0.05)。見表8。

表8 預存耐藥變異與HBV-DNA載量之間的關系

HBeAg陽性的患者其突變率高于陰性患者。但對突變組和未突變組HBeAg的表達情況進行χ2檢驗，兩組之間在HBeAg表達情況上的差異無統計學意義(χ2=2.261，P>0.05)。見表9。

表9 預存耐藥變異與患者HBeAg陽性率之間的關系

3 討 論

大量研究表明，CHB患者在NAs治療前就存在耐藥位點突變，即預存耐藥變異。該變異可能是引起抗病毒治療原發性無應答、應答不佳或部分病毒學應答的主要原因之一。預存耐藥變異產生的原因可能為以下兩方面。(1)HBV慢性感染期間與宿主免疫應答相互作用的結果：HBV-DNA逆轉錄酶缺乏嚴格的校對功能,每天能產生1010～1011個新發的核酸替換，形成大量的突變株。在遺傳變異、競爭及宿主的選擇壓力下，耐藥突變被逐漸篩選出來成為優勢株，或者僅存在于少量被感染的肝細胞中。受檢測方法的敏感度所限，預存耐藥變異的優勢株易被檢出，而非優勢株可能被漏檢，在臨床上可表現為治療前未檢測到耐藥突變，抗病毒治療后原發無應答、應答不佳或迅速檢測到耐藥突變[4]。(2)HBV耐藥株的水平或垂直傳播，即患者可能最初直接感染了耐藥株[5-6]。

本研究對未經NAs治療的401例CHB患者及慢性HBV感染者進行耐藥突變檢測，共檢出預存耐藥變異79例，耐藥率為19.70%，相關藥物的預存耐藥檢出率從高到低分別為ADV、LAM、FTC、LDT、TDF、ETV。類似研究中，預存耐藥變異多以LAM為主，ADV次之，其他藥物少見[7-8]。本研究中各種藥物均檢出了相關的耐藥位點預存變異，且ADV的預存耐藥變異較LAM更為嚴重，高達15.96%，較LAM高出一倍，此種差異可能與檢測方法、地域、用藥習慣等有關，原因有待進一步研究。

HBV預存耐藥的檢出率可能與檢測方法有關。蓋洪鵬等[9]采用微測序技術，檢出CHB患者的預存耐藥率為17.19%，突變位點主要與 LAM、ADV 耐藥相關。孫靜怡等[10]用基因芯片法檢測乙型肝炎相關性原發性肝癌術后患者的預存耐藥情況，提示預存耐藥檢出率為19.12%，相關藥物為LAM、LDT、ADV。饒友義等[2]、陳燦峰等[7]亦采用基因芯片法，預存耐藥檢出率分別為14.57%、15.57%，耐藥藥物為LAM、ADV。與基因芯片技術相比，以PCR擴增產物焦磷酸測序進行預存耐藥變異的檢出率較低，為4.92%～8.97%[11-12]。羅新月等[13]應用克隆測序法在60例CHB患者中檢出33 例逆轉錄酶區基因變異，預存耐藥檢出率高達53.3%。提示預存耐藥變異可能較文獻報道的情況更為普遍。受檢測方法的特異度與敏感度影響，預存耐藥變異的檢出率有較大差別，實驗室應按照實際情況，選擇合適的檢測方法。本研究采用基因芯片法進行突變檢測，檢出率為19.70%，與其他相同檢測方法的研究相比，檢出率相近。筆者認為，基因芯片法操作簡單，檢測時間短，檢出率較高，設備成本低，較適宜臨床推廣。

本研究突變位點主要集中在rtN236T、rtM204I、rtL180M，突變率分別為15.96%、6.98%和5.24%，rtM204I較rtM204V更為常見。與目前報道的預存耐藥位點多位于rtM204V/I、rtL180M、rtN236T基本一致[10-13]，但本研究中rtN236T的突變率較其他研究高。分析突變模式，單個位點突變48例，多個位點突變31例。前3位為rtN236T、rtN236T+rtM204I+rtM204V、rtN236T+rtM204I，其突變率分別為9.98%、2.24%及1.25%。與用藥后的耐藥突變相比，預存耐藥的單個點突變發生率較高，復雜程度較低，但單位點突變與多位點突變的患者在年齡、性別等方面的差異無統計學意義(P>0.05)，未統計病程長短方面的差異。有研究提示，伴隨疾病進展和治療的進行，突變的發生率及復雜程度明顯上升[13]。

統計分析預存耐藥突變可能的相關因素，提示預存耐藥突變組與未突變組，在年齡、性別、ALT、AST、病毒載量、HBeAg等方面的差異均無統計學意義(P>0.05)。但提示年齡<20歲及>60歲，肝酶>10 ULN，病毒載量>107IU/mL、HBeAg陽性的患者，其預存耐藥變異檢出率較高。此類患者可能更需要謹慎用藥，推薦抗病毒治療前進行耐藥基因突變檢測。為明確預存耐藥突變的影響因素，需加大樣本量，細化分組，增加病程、病理分型等研究因素，進一步研究影響其相關因素和發生機制。

在臨床治療方面，除目前臨床常用的LAM、ADV、LDT、TDF及ETV外，本文還對FTC進行了耐藥位點突變檢測。該藥物為胞嘧啶核苷類似物，最早用于HIV感染的治療。其耐藥突變位點與LAM相同，即rtM204V/I±rtL180M變異，本研究中預存耐藥檢出率為7.48%，與LAM一致。自2006年起，FTC被用于CHB的抗病毒治療,研究證實FTC聯合TDF抑制HBV作用優于TDF單藥制劑，并能夠減少耐藥發生[14]。其安全耐受性已獲得廣泛認可。目前推薦FTC與TDF聯合，用于初治與經治HIV/HBV共感染者。在充分的知情同意后，可用于兒童CHB患者、妊娠期HBV感染母嬰垂直傳播阻斷以及妊娠期HBV感染活動者的抗病毒治療[15],為CHB的抗病毒治療提供新的治療選擇[14,16]。

2016年更新的CHB NAs經治患者抗病毒治療專家共識[17]中指出，高病毒載量的CHB患者采用ADV、LAM或LDT等單藥治療時HBV-DNA低于檢測下限的比率較低，且耐藥變異發生率較高，其中ADV治療產生原發無應答的概率較大(10%～20%)，ETV、TDF治療發生原發無應答的概率較小。本研究中ADV、LAM、FTC、LDT的預存耐藥變異率較高，其中ADV的突變率最高，為15.96%，TDF及ETV的預存耐藥突變率僅為0.50%和0.25%，與指南中NAs原發無應答的概況相符，提示預存耐藥變異與原發無應答高度相關。寧德地區應遵循指南進行臨床診療，臨床醫師對預存耐藥變異應充分重視。在條件允許的情況下，治療前應進行耐藥基因突變檢測。若未進行耐藥突變檢測，寧德地區應慎用ADV等預存耐藥變異率較高的藥物。

寧德地區CHB患者及慢性HBV攜帶者的預存耐藥變異率較高，以rtN236T突變最為常見，相關藥物ADV應慎用。TDF、ETV的預存耐藥變異檢出率低，抗病毒治療時可首選?？共《局委熐斑M行多位點耐藥突變檢測，對指導個體化用藥具有重要的臨床意義。