哈爾濱地區(qū)產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌流行病學(xué)和耐藥基因研究*

高春波，蘇麗菊，柴 淼，張 萌，鄭力輝

(哈爾濱市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱 150010)

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌[1],可導(dǎo)致呼吸道感染、敗血癥、泌尿系感染、腦膜炎、腹膜炎等[2-5]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和不合理使用，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)幾乎各類化學(xué)結(jié)構(gòu)的臨床常用抗菌藥物呈現(xiàn)高度的天然固有耐藥性和獲得性耐藥性，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌[6]。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是主要耐藥機(jī)制之一[7]。產(chǎn)ESBLs可導(dǎo)致對(duì)青霉素類、1～3代頭孢菌素、單環(huán)酰胺類藥物耐藥，部分還可水解第4代頭孢菌素，給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[8]。因此，本研究探討哈爾濱地區(qū)的產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌流行情況及基因型，旨在控制其傳播并為該類抗菌藥物的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2017年4-7月哈爾濱地區(qū)2家綜合性三甲醫(yī)院(哈爾濱市第一醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共190株。標(biāo)本來自血液、痰液、肺泡灌洗液、分泌物等，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株。采用VITEK-2細(xì)菌鑒定分析儀進(jìn)行鑒定。

1.1.2主要試劑 藥敏紙片：氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、慶大霉素均購自英國(guó)Oxiod公司。血瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基均購自鄭州安圖生物有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自Takara大連寶生物工程有限公司，引物由上海生物工程公司合成。脈沖場(chǎng)級(jí)瓊脂糖購自美國(guó)Bio-Rad 公司，溴乙錠購自上海Sangon公司，PMSF購自Merk 公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)及ESBLs菌株篩選 采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)以上14種抗菌藥物的敏感性及進(jìn)行ESBLs菌株篩選。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，購自國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSL)2017年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.2.2基因檢測(cè) 采用PCR法擴(kuò)增主要的ESBLs編碼基因，包括PER-1、SHV-1、TEM-1、VEB、CTX-M、OXA-23基因型。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)報(bào)道[9]，反應(yīng)總體積為25.0 μL，包括0.2 μL Taq酶5 U/μL，含MgCl2的2.5 μL 10×緩沖液，2.5 μL dNTP，上下游引物各1.0 μL，3.0 μL DNA模板，14.8 μL ddH2O。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在Gen Bank網(wǎng)上進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.3脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析菌株同源性

1.2.3.1制備染色體DNA 將菌株配至4 麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海? mL 菌懸液12 000 r/min離心2 min，棄上清，取300 μL 細(xì)菌懸濁液于1.5 mL eppendorf管中，平衡至50 ℃;加入50 ℃等體積2% Clean-cut 瓊脂糖凝膠，充分混勻并迅速灌注模具，4 ℃冰箱中凝固20 min。將膠塊置于離心管中，加入溶菌酶液，37 ℃水浴箱孵育2 h，吸出溶菌酶液，無菌水清洗膠塊2次，然后加入蛋白酶K液(終濃度0.8 mg/mL)，50 ℃水浴箱中孵育24 h。清洗膠塊，吸掉蛋白酶K液，加1×TE緩沖液1 mL，室溫下輕輕振蕩30 min。吸出清洗液，加入1 mL酶終止液(PMSF，濃度為1 mmol/L)滅活剩余的蛋白酶K，室溫下輕輕振蕩30 min。再加TE液重復(fù)清洗3次，每次30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2細(xì)菌DNA限制性酶切 加入40 U限制性內(nèi)切酶Apa Ⅰ、10×內(nèi)切酶切緩沖液、0.1%牛血清白蛋白(BSA)12 μL，加入去離子水至120 mL，37 ℃水浴箱中孵育過夜。

1.2.3.3加樣和電泳 用0.5×TBE緩沖液配制1%的PFGE級(jí)瓊脂糖膠，在電泳槽中加入2 L TBE緩沖液，將消化好的細(xì)菌膠塊小心放入梳孔中，在空隙處加入融化的瓊脂糖凝膠進(jìn)行密封。電泳條件為14 ℃,電場(chǎng)強(qiáng)度6 V/cm,脈沖角120度，脈沖時(shí)間15 s,電泳時(shí)間20 h。電泳結(jié)束后，用0.25 mg/L的EB染色液染色30 min，蒸餾水清洗30 min，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像采集。

1.2.3.4PFGE結(jié)果判定 PFGE分子分型依據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)TENOVER等[9]推薦的方法判讀。圖譜完全相同的定義為一個(gè)型，彼此之間相差一個(gè)帶的定為同一型的不同亞型，相差2～3個(gè)帶的認(rèn)為親緣關(guān)系密切，相差4～6個(gè)帶的認(rèn)為可能相關(guān)，條帶相差7個(gè)及以上的認(rèn)為無親緣關(guān)系。并隨機(jī)選擇不同的字母如A、B、C、D等的字母順序分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET5.6軟件統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性分析 190株鮑曼不動(dòng)桿菌中，對(duì)米諾環(huán)素、替加環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分別為95.3%、93.2%、56.8%。耐藥率高于70.0%的抗菌藥物為頭孢他啶和派拉西林，其余藥物耐藥率均高于50.0%。見表1。

表1 190株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)14種抗菌藥的藥敏結(jié)果(%)

2.2產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌的基因型 190株鮑曼不動(dòng)桿菌中篩選出產(chǎn)ESBLs菌株共58株，檢出率為30.5%，PCR分析結(jié)果顯示PER-1基因型26株，TEM-1基因型23株，SHV-1基因型1株，OXA-23基因型24株，其中37.0%同時(shí)攜帶PER-1、TEM-1、OXA-23這3種基因型。其余基因型檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.3PFGE同源性分析 通過分析PFGE電泳圖譜，58株產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌主要分為5型，分別用A、B、C、D、E表示，來自哈爾濱市第一醫(yī)院的39株產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌菌株分為A、B、C型，以A型為主，為35株，其中A1亞型有27株，A2亞型有5株，A3亞型有3株；B型有3株；C型有1株。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院的19株產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌中，5株與哈爾濱市第一醫(yī)院A1條帶一致；12株為D型，其中D1亞型9株，D2亞型3株；2株為E型。

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，該菌在醫(yī)院的環(huán)境中分布很廣且可長(zhǎng)期存活，對(duì)危重患者威脅很大，可引起全身系統(tǒng)各個(gè)器官的感染，是引起院內(nèi)感染高發(fā)病率和病死率的重要原因[10]。近年來，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和抗菌藥物的濫用，多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌日益嚴(yán)峻，尤其是ESBLs介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來極大困難[11]。本研究中，在分離的190株鮑曼不動(dòng)桿菌中，對(duì)米諾環(huán)素、替加環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分別為95.3%、93.2%、56.8%。耐藥率高于70.0%的抗菌藥物為頭孢他啶和派拉西林，其余藥物耐藥率均高于50.0%，耐藥情況比較嚴(yán)重。

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌院內(nèi)感染和耐藥性已成為全球性防治難題[12]。研究表明，隨著廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用和抗菌藥物使用模式的不同，近年來，又出現(xiàn)了許多新的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因型，且因地域不同，特點(diǎn)也不盡相同[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌中ESBLs基因檢出率為30.5%(58株)，其中，以PER-1基因型為主，檢出26株，證實(shí)PER-1型在本地區(qū)為流行株。37.0%同時(shí)攜帶PER、TEM、OXA-23 基因型。

PFGE技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種重要的分離大分子量線性DNA的電泳技術(shù)[16]。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子(>10 kb)移動(dòng)速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶，PFGE的發(fā)明正好解決了這一難題，它可以用來分離大小從10 kb到10 Mb的DNA分子，具有高分辨力、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，使PFGE的應(yīng)用范圍已涉及到幾乎所有生物基因組結(jié)構(gòu)的研究，并被譽(yù)為細(xì)菌分子學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]。 本研究采用PFGE技術(shù)對(duì)本地區(qū)產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行流行病學(xué)分析。通過分析PFGE電泳圖譜，58株產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌主要分為5個(gè)克隆株，A1型為主要克隆株，在醫(yī)院內(nèi)、醫(yī)院間傳播，成為本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌不斷增加，耐藥率不斷上升的原因。因此，加強(qiáng)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和隔離，規(guī)范抗菌藥物的使用和管理，做好院內(nèi)感染，有效預(yù)防和控制本地區(qū)耐藥菌株的產(chǎn)生及傳播，具有很重要的意義和價(jià)值。

綜上所述，哈爾濱地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況嚴(yán)重。鮑曼不動(dòng)桿菌菌株產(chǎn)ESBLs酶是耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要原因。產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌以PER-1基因型為主，本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌流行株存在醫(yī)院之間交叉感染現(xiàn)象。