免疫層析技術的發展及在POCT中的應用

黃德智 綜述，蒲曉允審校

(陸軍軍醫大學新橋醫院檢驗科，重慶 400037)

1 免疫層析技術簡介

免疫層析技術是在20世紀60年代在發達國家興起并被用于檢測血清蛋白的一種結合了免疫技術和色譜層析技術的快速檢測分析方法，利用膠體金、膠體碳、磁性納米材料、稀土納米材料、量子點等著色標記物，在層析時，標記物與待測物的絡合物被相應的配體捕獲而濃集顯色于硝酸纖維素膜上的檢測線，以纖維膜上顯色條帶的有無、顏色深淺和反射光線來定性或定量，在即時檢測(POCT)中應用極為廣泛。免疫層析試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素(NC)膜、檢測線(T線)、質控線(C線)、吸水墊、聚氯乙烯(PVC)底板等部分組成，根據待檢測物的大小和抗原抗體結合的方式，分為雙抗體夾心法和競爭法[1-2]。

2 免疫層析技術發展及應用

免疫層析技術關鍵在于依靠標記抗體的免疫標記材料，而納米材料由于優越的信號放大作用，能達到良好的靈敏度和特異度而備受青睞。下面主要從膠體碳、量子點、稀土納米材料、上轉換發光技術和超順磁性納米材料以及適配體等方面進行介紹。

2.1膠體碳 與膠體金相比，膠體碳的優點包括更高的顏色強度，即更高的靈敏度和標記效率，動力學檢測范圍更廣，成本低廉，制作工藝簡單，可大規模生產且更環保，但由于其標記和封閉時間長，并未體現出對膠體金的絕對優勢，故其商業化程度較低[3-4]。何卓等[3]利用碳納米顆粒制作的膠體碳試紙條用于檢測瘧原蟲，并可通過掃描檢測帶灰度值以定量。最近，YU等[4]利用一種新的膠體碳材料氧化石墨烯作為標記物，成功制作出用于檢測黃曲霉素B1的試紙條，肉眼最低檢測限可達0.3 ng/mL。材料學的進步能促進檢測的進步，諸如碳量子點和石墨烯量子點等材料也是免疫層析研究中可以利用的標記材料。

2.2量子點 量子點被認為是免疫層析中最有前途的熒光半導體納米材料，與一般熒光染料相比，量子點具有尺寸可調的熒光，發射光譜窄而對稱，高量子產率，寬吸收光譜，熒光強度高，耐光漂白和穩定性好等優點[5-6]。水溶性量子點表面富含羧基或氨基以用于連接蛋白質。表面是羧基的量子點被1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)激活，并且這些激活的羧基和抗體的氨基相連接。這些特性使得量子點是一個可以達到高靈敏度和同時對多種檢測物定量的免疫層析標記物[7]。為了檢測樣本中不同的物質，有兩種不同模式的檢測方法。第一種模式是不同的T線去檢測與之對應的分析物；第二種模式是一條T線去檢測不同的分析物。例如，第一種模式，TARANOVA等[8]設計了一種“交通信號燈”式的競爭性免疫層析方法，他們使用的多色彩的量子點作為標記物以同時檢測牛奶中的氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素，有625、585、525 nm的3種不同發射峰的水溶性量子點被用于制作成3條不同顏色的檢測線，分別是紅色、黃色和綠色。在這種“交通信號燈”式的檢測方法中，氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素的檢測限分別達到了0.30、0.12、0.20 ng/mL，比酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法的檢測限低了80～200倍。第二種模式，WANG等[7]設計的一種以多色量子點為標記物的雙抗體夾心免疫層析試紙條，這種試紙條只有一條T線，可同時檢測甲胎蛋白和癌胚抗原，檢測限分別為3、2 ng/mL。雖然量子點有諸多優點，但量子點也有缺點。例如，量子點在生物環境下化學性質和膠體性質的不穩定性可能會導致定量不準確。所以，最近已經有幾個研究小組都已經開發了一種新的方法，把量子點包被到納米顆粒表面或里面形成量子點微球，以提升其化學和膠體穩定性，并借此通過量子點的數量來擴大檢測信號[8-9]。丁喬棋等[10]以羧基化CdTe/ZnSe量子點熒光微球為標記物制作的免疫層析試紙條檢測牛奶中的氯霉素，檢出限為0.1 μg/L。量子點提高穩定性后，在多聯檢測上是很有前途的納米材料。

2.3鑭系元素 鑭系元素是第57號元素鑭到71號元素镥共15種元素的統稱，用符號Ln表示，鑭系元素和免疫層析技術相結合形成時間分辨熒光免疫分析層析技術(TRFICA)[11]。與傳統熒光標記物相比，鑭系元素有獨特的熒光特性：熒光壽命長，激發光和發射光的波長差(stokes位移)大，激發光譜和發射光譜無交叉，特征峰非常尖銳，標記物體積小(原子標記)，標記物不會影響被標記物(尤其對蛋白質的影響小)的空間立體結構，保證了被檢物質的穩定性，且可以實現多位點標記等特點。通過有效利用波長分辨和時間分辨技術排除非特異熒光，實現了高信噪比和靈敏度，以時間分辨技術測量特異熒光，對待檢物質進行定量分析，解決了普通熒光分析中材料和樣品中非特異熒光產生的高背景問題，其中Eu最為常用[12-13]。LIANG等[14]用 Eu3+敖合的聚苯乙烯微球作為標記物制作的時間分辨熒光免疫層析試紙條以檢測甲胎蛋白，該研究小組是以T線熒光值/C線熒光值(HT/HC比率)來定量檢測甲胎蛋白，以HT/HC比率來定量可以消除試紙條之間的固有異質性和檢測標本的基質效應，使得結果準確性和重復性更好。最后該小組檢測甲胎蛋白的線性范圍達到1.0～1 000.0 IU/mL，最低檢測限達到了0.1 IU/mL，與商用的化學發光試劑盒結果符合性優異。同樣地，TRFICA一樣可以實現一個試紙條檢測多種物質。WANG等[15]用競爭法，在NC膜上劃了1條C線和3條T線，3條T線分別用于檢測3種不同的β-受體激動劑：鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇。理論上講，TRFICA的靈敏度可以達到10～18 mol/L，但在現有的研究中還不能達到，所以以后的研究仍須進一步發揮其高靈敏度的優勢。

2.4上轉換發光技術 上轉換發光技術即以稀土金屬元素 (主要是鑭系) 構成的納米或亞微米顆粒作為標記物的免疫層析技術[16]。上轉換發光材料在紅外激發光下可發射出不同波長的可見光，使其具有抗光漂白能力強、反斯托克斯位移寬、毒性低、背景熒光干擾小、發光特性穩定等有點，在免疫檢測中可提高靈敏度和信噪比，尤其適用于復雜樣本的檢測[17-20]。雷萌等[21]研制基于上轉換納米熒光快速定量檢測降鈣素原的免疫層析檢測技術，最低檢測限為0.02 ng/mL，線性范圍為0.05～44.00 ng/mL。 基于上轉換發光尤其適用于復雜樣本的檢測的特點，可以開發基于上轉換發光的多聯檢測試紙條。

2.5磁性納米微球 在傳統的免疫層析方法中，定量主要依賴于測試儀去讀取可見光或熒光，但這種方法的劣勢就是只能檢測到膜表面及以下10 μm這部分的可見光或熒光。然而，通常NC膜的厚度一般是數百微米，分析物在層析時，從膜表面到底部均有指示物質的分布，這樣就造成了多達90%或以上的指示物質未被肉眼或光學儀器所測量到，這對于檢測的靈敏度是個極大的損失。而基于超順磁納米顆粒(MNPs)作為標記物的免疫層析方法，利用磁信號分析儀(MAR)可以實現對膜上信號的完整讀取，不用去考慮膜的厚度問題，這樣可以把靈敏度提高10～1 000倍，而且試紙條在長時間放置后磁信號并不會有明顯損失，生物材料中有鮮有磁信號，因此，對試紙條的干擾很小，所以這樣的方法可以達到很高的靈敏度、準確性和穩定性[9,22-23]。基于超順磁納米顆粒的免疫層析法，定量的檢測模式有兩種：第一種模式是在振蕩的磁場中，用巨磁阻傳感器去檢測T線上所有磁性納米顆粒的磁化飽和強度；第二種模式是在磁場中，利用磁信號檢測儀去掃描NC膜上各個部分以得到磁通量[9]。然而兩種模式使用的檢測儀器不適宜普及，WU等[24]利用智能手機的相機和成像技術把質控線和檢測線上的磁珠抗體顏色強度轉化成數字信號來給尿液中的可卡因定量。GONG等[25]也利用磁性微球建立了同時檢測心肌肌鈣蛋白I和肌酸激酶同功酶(CK-MB)的方法，最低檢測限達到了0.049 ng/mL和0.085 ng/mL。這也為以后用磁性微球建立免疫層析的方法做出了一定的指引，可以利用身邊的智能設備如手機等作為檢測設備，做到更加高效快速的檢測。

2.6適配體 傳統的免疫層析法用抗體作為標記物和捕獲物，現在隨著指數富集的配基系統進化技術(SELEX)的應用，配對的適配體也逐漸篩選出來。適配體相對于傳統的抗體來講，具有諸多的優勢：篩選周期短，親和力和穩定性高，特異度強，重復性好，易于合成和修飾，成本低，易于保存，無免疫原性和毒性，可與細胞、重金屬、蛋白質、細菌和病毒等靶標適配[26-27]。AHMAD RASTON等[28]利用SELEX篩選絲氨酸蛋白酶抑制劑的同源適配體結合膠體金技術檢測絲氨酸蛋白酶抑制劑，在溶液和血清中的檢測限分別達到了0.137 nmol和0.105 nmol。WU等[26]也首次用適配體檢測玉米赤霉烯酮，檢測限達到了20 ng/mL。由于適配體的諸多優點以及SELEX技術的逐漸成熟應用，在免疫層析上用適配體來代替抗體檢測是一個好的方向。

3 結論和展望

本綜述介紹了免疫層析法的設計組裝、反應原理及主要標記物種類和在POCT的應用，包括床旁檢測、食物檢測和環境監測等。經過幾十年的發展，從最初的膠體金，到后來的膠體碳、量子點、稀土發光材料、上轉換發光材料、超順磁納米微球和適配體等，以及本文中還未提及的脂質體等材料，各種材料都被人們發現并運用，使得免疫層析得到長足的發展和廣泛應用。定量、提高靈敏度、多聯檢測和環保是未來依然要努力的方向。總之，多種多樣的標記材料已經在免疫層析法上有所使用，也各自展現了自己的優勢和劣勢，應進一步對此深入研究，以使得其更好地應用于臨床檢測、食品檢測和環境監測等。