脂褐素與年齡相關性黃斑變性

羅茂梅，蔡善君

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發達國家55歲以上人群的主要致盲原因，其病因被認為是由多種因素引起的，包括持續氧化應激、慢性炎癥、遺傳和環境易感因素等[1]。ARMD的患者數以百萬計，并且可能隨著人口壽命的延長而增加[2]。ARMD能影響患者黃斑，導致中心視力喪失，嚴重影響患者的閱讀、看電視或駕車的能力[3]。大約90% ARMD患者病程緩慢進展，稱為干性ARMD，特點是進行性色素上皮萎縮，然而該疾病可以轉變為更嚴重的形式，稱為濕性ARMD，特點是脈絡膜新生血管，引起一系列出血、滲出和瘢痕改變，它是ARMD導致視力喪失的主要因素。導致ARMD發展以及從干性向濕性轉變的機制尚不清楚，雖然這種疾病的治療方案越來越多，但是目前還沒有有效的治療方法。脂褐素(有時稱為“老化色素”)是細胞內的熒光色素顆粒，主要積聚在有絲分裂后細胞，如神經元細胞、心肌細胞和視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞[4]。脂褐素隨著年齡增長而緩慢積累，一般來說它是氧化的蛋白質、脂質、碳水化合物、金屬(主要是鐵)和其他有機分子的混合物，但是這種混合物因來源的組織而異[5]。脂褐素對細胞功能的作用目前還不清楚，但人們普遍認為，脂褐素的積累會增加機體對氧化應激的易感性，降低溶酶體的降解能力，RPE細胞中脂褐素隨著年齡增長的聚積也被認為是ARMD的主要危險因素。

1脂褐素的形成與組成

脂褐素隨著年齡的增長而逐漸積累，是在多種病理生理條件下形成的，如氧化應激和老化，其基本特征是蛋白質損傷和清除之間的不平衡，導致蛋白質內穩態失調，氧化蛋白質聚集體積累，隨后高交聯材料如脂褐素和類脂褐素脂質體積累，影響細胞活力[6]。因此，脂褐素被看作是吞噬和自噬過程中未被消化的細胞物質的聚集體，作為內質顆粒堆積[6]。在RPE中形成的脂褐素主要來源于RPE細胞吞噬光感受器外段脫落的膜盤，被吞噬的膜盤在溶酶體內未被完全消化，殘留物便聚積形成脂褐素。正常人視網膜后極部脂褐素濃度最高，中央凹脂褐素含量最少，維持終身不變，這與視網膜的局部功能和視桿細胞分布是相對應的[7]。在一位80歲患者的RPE細胞中脂褐素約占細胞體積的19%。導致脂褐素積累的增加可能與光照、RPE65以及基因突變致ABCR活性減低有關。光照會引起全反式視黃醛釋放過多的脂褐素前體，而光感受器間的視黃醇結合蛋白可以在視桿外段清除全反式視黃醇和視黃醛，防止脂褐素前體的形成，但不能去除已經存在的前體。據報道，溶酶體酸化可以防止ARMD患者受損的RPE細胞堆積脂褐素[8]；Hohn等[9]認為自噬體和溶酶體并非強制性地參與脂褐素形成，而是充當此類生物分子聚集的儲存場所，從而有助于減輕其細胞毒性；Ureshino等[10]發現細胞內脂褐素積累會損害巨噬細胞的自噬能力。最新研究表明脂褐素形成可以發生在溶酶體室外，并且獨立于巨噬細胞吞噬過程，這是由于在衰老過程中有絲分裂和自噬普遍減少，但脂褐素的形成卻仍然增加，線粒體裂變的抑制和線粒體蛋白質的持續氧化是年齡相關的脂褐素形成的重要因素[11]。

從RPE脂褐素中分離出的第一個化合物是N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)，它是脂褐素的主要成分，屬于類視黃醇家族，通過NADPH氧化酶催化產生超氧化物而具有毒性，導致RPE細胞死亡[12]。A2E具有特殊的楔型結構，由一個獨特的吡啶極性頭基團和兩個疏水的維甲酸尾組成，因此不易被溶酶體酶識別難于被降解。A2E的生物合成是一種多步驟過程：包括視錐和視桿細胞吸收光，產生全反式視黃醛，兩分子全反式視黃醛與一分子乙醇胺反應形成N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺(A2PE-H2)，然后A2PE-H2被氧化為A2PE，它是A2E的直接前體，當光感受器脫落的膜盤被RPE細胞吞噬后，在溶酶體內酶切形成A2E[13]。視循環過程中產生過多的11-順式視黃醛也可在視桿細胞中直接形成A2PE[14]。由于光感受器外段的完全替換約10d，A2PE便不連續地積累在感光細胞，因此防止A2PE的積累有助于外段膜的不斷更新。A2E可被體外合成且已廣泛用于研究，探討其參與視網膜隨著老化而發生的破壞性過程。A2E大致分布規律在遠周最高，向中心下降[13]。

2 RPE細胞脂褐素的自發熒光特性

RPE細胞聚集的脂褐素是眼底自發熒光的來源，其成分復雜，含有20多個熒光團，主要是類視色素二聚體及其光氧化和光降解產物[15]。在人視網膜組織切片中記錄RPE脂褐素熒光，發現其信號從黃斑中央凹向周圍增加，在距中心凹8°處達到高峰后，向周邊減少[16]。眼底中央凹自發熒光少的主要原因黃斑色素對激發光的吸收和RPE中心有高密度的黑色素。脂褐素顆粒中熒光團的組成可隨年齡或病理改變而變化，進而可導致眼底自發熒光光譜特征的改變[17-18]。事實上，眼底自發熒光的光譜光度測量表明，65歲時的熒光比25歲時的熒光強2.8倍，但自發熒光在70歲以后會下降，可能是由于RPE細胞隨年齡減少，另一個促成因素可能是A2E光氧化相關的熒光下降。由于RPE脂褐素的自發熒光色素是由全反式視黃醛產生的，所以當11順式和全反式視黃醛發色團不能通過視循壞產生時，比如在與RPE65突變相關的早發性視網膜營養不良中，將不存在眼底自發熒光[19-20]。此外，通過眼底熒光成像對RPE脂褐素的體內監測已經證明，RPE顯示出強烈自發熒光的區域容易萎縮，自發熒光增加的病灶區域是進展為ARMD的危險因素。眼底自發熒光激發光譜在490～510nm(體內)和590～630nm(體外)達到峰值[21]，RPE脂褐素激發光譜在590～600nm達到峰值[22]。眼底自體熒光的光譜特征與RPE脂褐素的光譜特征一致，當被逐漸變長的波長激發時，整個脂褐素記錄的發射光譜顯示出紅移[23]。有研究表明脂A2E在眼底自發總熒光強度中并不占優勢，A2E的氧化形式比A2E本身具有更強的熒光，A2E對眼底自發總熒光強度的貢獻不大[18,23]。Tatiana等發現在不同激發波長和發射波長下，A2E和iso-A2E的熒光強度明顯低于其他熒光團[18]。

3 RPE脂褐素引起ARMD的可能機制

3.1 RPE脂褐素對細胞的影響在體內，局部脂褐素含量與鄰近感光細胞的損傷直接相關，表現出對RPE細胞的毒性[24]。超過一定濃度的A2E或脂褐素能破壞RPE的細胞膜、從線粒體分離促凋亡蛋白、損害溶酶體功能(抑制溶酶體質子泵、堿化溶酶體并增加溶酶體內膽固醇含量而抑制吞噬功能)等，造成RPE損傷[25]，這些可能與A2E的特殊結構有關，A2E的兩親性結構導致其能聚集、誘導洗滌劑樣膜完整性喪失、溶解單層膜的脂質雙層并引發膜泡起泡。而Cheng等[26]發現A2E在破壞線粒體膜方面特有效，可能是由于帶負電荷的線粒體膜和帶正電荷的A2E分子之間有很好的相互作用。Wang等[27]認為A2E的光氧化會引起DNA損傷，包括端粒去保護作用，進一步加速RPE細胞的衰老，并導致旁分泌效應，影響整個視網膜環境，從而可能導致視網膜變性。脂褐素還被證明可與氧化還原活性的金屬比如鐵結合，產生活性氧，誘導細胞凋亡，脂褐素導致細胞損傷和細胞毒性的程度似乎與脂褐素本身存在的鐵濃度密切相關[11,28]。Parmar等[29]利用誘導多能干細胞來源的RPE細胞與10μmol/L的A2E共培養，發現與時間成正比的細胞死亡數的增多，并出現血管內皮生長因子上調和26種前體炎性因子上調，促進脈絡膜新生血管的形成，引起視網膜炎癥，導致RPE細胞損傷。一些研究表明，A2E本身并不會引起RPE細胞死亡，反而可刺激RPE細胞自噬，防止損傷細胞的積累[30-31]，自噬在保護RPE免受氧化應激和脂褐素積累中起著重要作用，但當自噬能力隨著脂褐素積累的增加而下降時，可加速ROS生成和蛋白聚集，激活炎癥反應，進一步誘發RPE長期的炎癥、加速老化過程、細胞變性，最終可導致細胞死亡[32]。脂褐素還有一個重要特征是它能通過競爭性結合蛋白水解酶抑制氧化蛋白降解，包括20S蛋白酶體和溶酶體蛋白酶，導致脂褐素的進一步積累，增強它的細胞毒性[6]。

3.2 RPE脂褐素的光氧化隨著年齡的增長，RPE細胞中光氧化和光降解產物水平的增加尤其可能增加ARMD的風險。Zareba等[33]發現原代培養人RPE細胞的光損傷程度與其內源性脂褐素含量成正比。Kim等在分離的人和小鼠視網膜色素上皮中檢測到A2E和全反式視黃醛二聚體的光氧化形式，提出光氧化在眼睛中是一個持續的過程[24]。對RPE脂褐素和單個脂褐素熒光團(如全反式視黃醛二聚體和A2E)的研究表明，這些化合物是單線態氧和超氧化物陰離子等活性氧的光誘導發生器[34-35]。用藍光對人RPE分離的脂褐素顆粒進行有氧光活化，可產生單線態氧、超氧陰離子和過氧化氫等大量氧自由基[36]，引發細胞膜功能異常、溶酶體和抗氧化酶失活，尤其是A2E在藍光激發下形成有害的A2E-環氧化物能加速活性氧產生，引發RPE細胞損傷[34]。RPE脂褐素的光毒性在體外研究中也得到證實，在人RPE細胞培養基中預載脂褐素顆粒，暴露于390～550nm光下，脂褐素光敏細胞表現出明顯的形態學改變，溶酶體完整性喪失，脂質過氧化增強，存活率顯著降低[37]。Magdalena等首次證實人RPE脂褐素顆粒誘導的光氧化會損傷RPE細胞的特異性吞噬活性，抗氧化劑具有中和脂褐素產生活性氧的作用[38]，證實了活性氧以及氧化應激在ARMD發生過程中的重要性。

A2E和全反式視黃醛二聚體光氧化后能刺激補體激活[39]，還可導致Abca4突變小鼠的Bruch膜增厚和光感受器細胞變性[40]。Yamamoto等[41]觀察到靈長類動物體內RPE脂褐素熒光下降，這可能是由于脂褐素有光氧化和光降解的傾向。在任何給定時間，眼底自發熒光的強度可能是熒光團合成與RPE中脂褐素光氧化/光降解不同步的結果。在視網膜血管的陰影下，由視黃醛(11-順式轉換為全反式視黃醛)形成的脂褐素可繼續有增無減，但脂褐素光氧化將顯著減少[14,42]，因此視網膜易位比如視網膜脫離時會顯示出更強烈的自體熒光的血管印記。

3.3其他脂褐素色素的積累是正常RPE的特征，但是在Abca4基因突變相關的視網膜疾病(比如隱性Stargardt病)中特別豐富，20～29歲的Stargardt患者的自發熒光強度甚至比60～69歲的正常人高2倍，Abca4中某些突變的致病雜合體也表現出對ARMD的易感性增加[43]。RPE脂褐素的光氧化產物還可激活補體，引起慢性炎癥過程，逐漸使黃斑患病，因此補體激活未被充分調節也被認為是與ARMD易感性的基礎[44]。此外，視網膜下小膠質細胞中脂褐素隨年齡增加而積累，能促進炎癥和補體激活與沉積，進而驅動ARMD病理過程中視網膜外免疫失調[45]。載脂蛋白B隨年齡增長沉積在Bruch膜中形成脂質壁，與上述產生的活性氧作用產生炎性過氧化脂質，引發新生血管，從而參與玻璃膜疣的形成，玻璃膜疣是ARMD特有的富含脂質的細胞外病變。

4小結

雖然RPE脂褐素是引發ARMD的主要因素這一觀點尚未得到證實，但脂褐素參與ARMD病因學的證據不容忽視，越來越多的跡象表明RPE脂褐素過度積累可導致細胞功能障礙，并導致視網膜老化和退化。因此我們應努力了解ARMD發生發展過程中RPE脂褐素所起的作用，以及與其他因素之間的可能聯系，從而為ARMD的預防與治療提供巨大幫助。