miR-132在糖尿病視網膜病變患者血漿中的表達及其臨床意義

劉 茹，陸曉和

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最嚴重和最為常見的微血管并發癥之一。世界衛生組織公布，DR是全世界導致視力缺損和失明的第二大原因，已成為眼底病基礎和臨床研究領域的難點和熱點，探究DR的發病機制及預防策略具有重要的臨床意義。

miRNAs可參與腫瘤形成、炎癥反應、細胞增殖和凋亡、糖尿病和心血管疾病等多種病理生理過程。miRNAs也存在于人的循環血液系統中，能夠從外周血檢測，而且穩定性與重復性相對較好[1]。與mRNA不同的是，miRNAs在體液中相對穩定，甚至能抵御RNA酶的消化作用[2-3]。這一特性使外周血miRNAs檢測有望成為惡性腫瘤及其它疾病新的非創傷性的標記物[4-5]。在對DR的研究中，視網膜組織標本很難獲得，為病理檢查和病理分析帶來很大困難，因此如果外周血miRNAs檢測能夠作為標記物應用于臨床，這對于DR患者將具有更為顯著的臨床意義[6-7]。臨床上，miRNAs在玻璃體液和房水中也可以檢測到特異性的表達[8-9]，Hirota等[8]研究表明，與新生血管化和纖維化有關的幾種miRNAs在DR患者玻璃體液中的表達明顯高于黃斑裂孔患者。這就使得miRNAs在玻璃體和房水中的表達差異可以提示某種疾病，為臨床提供一種診斷和預后的分子生物學標志。Wu等[10]在鏈霉素注射10wk后成功建立糖尿病大鼠模型，并在糖尿病大鼠模型的視網膜內發現有11中microRNAs明顯升高，包括miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-135b、miR-592、 miR-190b、miR-363、miR-29c-5p，并且有6種MicroRNAs顯著降低，包括miR-10b、miR-10a、 miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a-3p。同時驚喜地發現，部分microRNAs在視網膜內表達量的變化與DR的發展一致，這就表明microRNAs調節與DR之間有某種聯系。

microRNA-132(miR-132)是馬克斯普朗克學會Lagos-Quintana等[11]2002年在小鼠神經組織中首次發現的，有研究表明[12]，miR-132與胃癌的預后密切相關。最近Marler等[13]通過體外和體內實驗發現經由miR-132與p250GAP途徑，腦源性神經營養因子促進小鼠胚胎視網膜神經節細胞的生長。臨床上，我們發現處于同一階段的糖尿病視網膜視神經病變，預后可能截然不同，提示我們可能視網膜神經節細胞損傷程度不同，這就迫切需要一種分子生物學標志能夠提示這種凋亡。已有研究表明[14]，miR-132在DR大鼠血管內皮細胞中表達水平升高，那么在DR患者循環體液中miR-132的表達情況，目前尚不清楚。本研究通過探討miR-132在不同分期DR患者血漿中的表達變化，有助于揭示miRNA-132與DR發展的關系，以期為DR尋求新的生物標志物。

1對象和方法

1.1對象選取2015-07/10于我院內分泌科確診的55例糖尿病患者，并由眼科醫師專人行眼底散瞳檢查和熒光素血管造影(fluorescein angiography，FFA)檢查，所有患者抽血前均未接受過眼部治療。糖尿病診斷標準[15]：空腹血糖>7.0mmol/L或者OGTT 2h血糖>11.1mmol/L和糖化血紅蛋白>6.5%。按DR國際臨床分期標準將患者分為5組：背景期：無明顯視網膜病變組13例(A組)；非增殖期(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)33例，包括輕度NPDR組10例(B組)，中度NPDR組11例(C組)，重度NPDR組12例(D組)；增殖期(proliferative diabetic retinopathy，PDR)9例(E組)。另選取我院體檢健康者12例作為陰性對照組(F組)。排除標準：眼部手術史，伴有嚴重高血壓病、嚴重高血脂癥、惡性腫瘤、肺部疾病及自身免疫性疾病患者，合并其他影響糖代謝的疾病(如甲狀腺功能亢進等)，急性代謝紊亂綜合征，嚴重心腦血管疾病及外傷等。所有研究對象的年齡及是否規范控制血糖差異無統計學意義(P>0.05)。本次研究經郴州市第一人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象均為自愿參加本次試驗，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集由專人收集研究對象的一般資料，包括：性別、年齡、既往史、個人史、糖尿病持續時間、血糖、糖尿病并發癥、用藥史。

1.2.2試驗方法抽取所有研究對象肘靜脈空腹全血5mL，按照Tiangen miRNA提取試劑盒進行操作提取RNA，并檢測RNA純度，miRNA-132逆轉錄應用加尾方法，U6應用普通逆轉錄方法逆轉錄通用引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T )24N( A，G，C)-3’。PCR下游引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；miRNA-132上游引物：5’-TAACAGTCTACAGCCATGGTCG-3’。U6上游引物： 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用SYBR Green I染料法進行熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測，PCR反應條件為：95℃預變性5min，1個循環；95℃變性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40個循環，測量miR-132和U6的相對表達量。

2結果

2.1基本資料DR各組與健康對照組在男女構成比例方面，差異有統計學意義(P=0.049)；各組在年齡、是否規范治療方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各組間糖尿病病程比較，差異有統計學意義(P=0.010)，糖尿病病程越長，DR越重(表1)。

2.2 PCR產物熔解曲線熔解曲線分析結果顯示熔解曲線形成單一峰，表明無非特異性產物和引物二聚體形成，引物的特異性良好(圖1)。

2.3 miR-132在各組患者血漿中的表達及與臨床資料的關系與健康對照組相比，除無明顯視網膜病變組外，其余各組DR患者血漿miR-132的表達水平均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；非增殖期各組間、非增殖期與增殖期組間比較，miR-132表達量差異均無統計學意義(P>0.05，圖2)。本試驗收集患者年齡、性別、糖尿病病程、是否規范治療作為影響患者血漿miR-132表達的因素。對以上因素與血漿中miR-132含量的關系進行分析，結果發現以上因素均與血漿miR-132表達無相關性(P>0.05)。

3討論

目前，miRNAs表達量的檢測方法主要有4種：實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、miRNA芯片微陣列、分子探針技術、直接測序技術。其中qRT-PCR較其他方法特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確，更適合分析體液中得到的miRNAs。本研究中我們采用qRT-PCR方法檢測糖尿病患者血漿中miR-132的相對表達水平，且PCR熔解曲線為單一波峰，說明miR-132引物的設計和反應條件的優化均較好，另外我們在試驗中有效地避免了RNA酶的污染，同時采用U6作為內參，提示本試驗的數據具有較高的可信度。

表1 糖尿病視網膜病變患者和健康對照組的臨床特征

分期例數性別(例,%)男女年齡(x±s,歲)病程(x±s,a)是否規范治療(例,%)是否背景期組135(39)8(61)55.2±3.123.9±2.74(31)9(69)輕度NPDR組104(40)6(60)56.1±5.85.8±3.77(70)3(30)中度NPDR組113(27)8(73)59.3±8.98.9±4.86(55)5(45)重度NPDR組124(33)8(67)63.1±11.812.6±5.54(33)8(67)PDR組92(22)7(78)63±16.116.2±4.63(33)6(67)健康對照組126(50)6(50)57.4±4.70-- P0.0490.3270.0100.526

圖1miR-132與U6熔解曲線A：miR-132；B：U6。

圖2miR-132在各組患者血漿中的表達A：miR-132在各組患者血漿中的表達；B：miR-132在NPDR與PDR兩組的表達。aP<0.05vs健康對照組；cP<0.05vs背景期DR。

miRNAs的自身結構比較特殊，目前應用較多的有兩種檢測方法：莖環法和加尾法，在原理上存在差異。兩種方法的反轉錄引物設計原則不同，而PCR 擴增引物的設計原則是相同的，也遵守常規PCR的引物設計原則。這兩種方法的思路不同，導致引物設計和試驗方法上的差異。二者各有優缺點，莖環法引物設計較困難，大量檢測成本高，但其特異性、靈敏度高于加尾法；而加尾法引物設計相對簡單，操作容易。本試驗中，最初設計用莖環法，但是在預試驗中發現，莖環法PCR結果中，水的PCR產物中出現目的條帶，提示我們存在污染可能性，后改為加尾法進行miRNAs的qRT-PCR試驗。

miRNAs一般在細胞間隙內發揮生物學作用，但在人類生物體液，如血清、血漿、尿液、唾液、淚液、房水和玻璃體中也能檢測到穩定的miRNAs[16]，體液中的miRNAs不僅是在標準狀態下穩定，而且在經受冷凍、pH劇烈變化、長時間放置室溫下都不會發生改變[3]，因此人們設想把它作為人類疾病病理學的分子標記來進行研究，并且在很多疾病中已經報道了循環中的miRNAs表達譜，包括糖尿病疾病[17-19]。miR-132在糖尿病大鼠的視網膜血管內皮細胞中表達上調[14]，而在DR患者外周血循環中miR-132的表達情況，尚未見相關文獻報道。

本研究發現miR-132在健康人和無明顯DR患者血漿內表達量相對較高，在非增殖期和增殖期DR患者體內miR-132表達量降低，這提示在DR發展過程中，miR-132有可能也起了保護視網膜神經節細胞作用，從而阻止DR的發展，當miR-132下降時，可能提示病變進展，但隨著DR程度加重，miR-132表達量差異無統計學意義。而Kovacs等[14]研究表明，miR-132在DR大鼠血管內皮細胞中表達水平升高，與我們的試驗結果不一致，分析原因本次試驗檢測的是視網膜神經節細胞，而Kovacs等檢測的是miR-132在DR大鼠視網膜血管內皮細胞中的表達情況，這可能是導致結果差異的原因；本次試驗中發現miR-132含量在糖尿病視網膜病變患者血漿內含量相對較低，導致循環熒光域值(CT值)較大，PCR結果可能存在誤差，因此后續試驗需要進一步更為精確的檢測方法。有研究表明，在DR中MAPK1/3信號通路對視網膜血管損傷和視網膜神經節細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的釋放有關鍵調節作用[20]。同時，MAPK3/1與DR病變的發生、發展密切相關，與視網膜神經節細胞凋亡有關。而miR-132對小鼠胚胎視網膜神經節細胞的生長有促進作用[13]。那么miR-132與MAPK1/3信號通路在DR發展中的具體作用及對視網膜神經節細胞的保護作用機制，我們將通過對高糖誘導的視網膜神經節細胞進行進一步的深入研究。