角膜新生血管的顯影方法

許 多，何宇茜，王瑞卿，李富強，姚博遠，張 妍

0引言

生理條件下，角膜是不含血管和淋巴的透明介質，因此被免疫系統忽略而處于“免疫赦免”的狀態。但在病理條件下，角膜緣的血管向角膜內延伸，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)因此形成。目前常見的方法，如激素治療[1]、細針透熱[2]、光動力療法[3]等，只能在一定程度上抑制CNV的生長，作用時間短，并伴有副作用，因此對CNV特異性抑制的治療方法還在不斷探索。CNV會引起視力下降、視物模糊，甚至失明[4]，在探索藥物療效的研究中，CNV的面積是衡量藥物或者治療方案效果好壞的重要參考，CNV高效清晰的顯影對研究也有重大價值。目前針對CNV的顯影方法有顯影劑造影、免疫組織化學法、光學相干斷層成像技術(optical coherence tomography，OCT)等。本文就CNV的顯影方法進行綜述，分析每一種顯影方法的優缺點，希望能對后續的研究起到一定的參考作用。

1顯影劑造影

用顯影劑對CNV造影可以實時快速地成像，具有操作簡單、易于觀察等優點。造影后的圖像使用熒光顯微鏡技術進行觀察，但是熒光顯微鏡得到的圖像質量不高，分辨率較低。隨著技術的發展，激光共聚焦技術[5]顯著地提高了分辨率，并且能對切片進行三維成像。

1.1熒光素鈉熒光素鈉(fluorescein sodium)分子式為C20H12O5，分子量為332D。利用熒光素鈉對CNV造影是經典方法之一[6]，將熒光素鈉注入靜脈，或者從左心室灌注，熒光素鈉隨著血液流入血管，使CNV清晰可見[7]。熒光素鈉被藍光激發時顯示出黃綠色光。由于它不參與機體代謝，因此該方法具有毒性低、不良反應少等優點，現在也用于檢查角膜是否破損。傳統觀點認為，角膜完好的地方不著色而僅在損傷處染色，但有趣的是，在Bandamwar等[8]研究中發現，健康內皮細胞也可以被著色，不過破損或者衰老的細胞顯示出更強烈的熒光[9]，即“中等強度背景下的超熒光”(hyper-fluorescence)。

1.2吲哚菁綠吲哚菁綠(indocyanine green)的化學式為C43H47N2NaO6S2，分子量為775D。同樣，吲哚菁綠也能與血漿白蛋白、球蛋白等物質結合，但對血管的顯示更加精細，具有輪廓清晰、定位精確等優點，目前已應用于臨床，因為它可以增強眼內結構層次的對比度，從而使手術更加方便。在實際操作的時候，可以將吲哚菁綠和熒光素鈉混合進行染色[2,10]。不過以上兩種染色方式均為侵入性檢查，需要在靜脈中注射造影劑才能顯影，也會在一定程度上損傷眼組織。有文獻報道，吲哚菁綠對視網膜有潛在的毒性，并且滲漏的造影劑也會降低顯影效果，影響最終結果的評估。

1.3伊文氏藍伊文氏藍(Evans blue)是一種偶氮染料[11]，分子量為960.8D，化學分子式為C34H24N6Na4O14S4，能不可逆地結合血漿白蛋白，形成復合物。而血管內皮細胞膜上有血漿白蛋白受體，其與血漿白蛋白親和力較強，因此可以通過灌注方法顯示血管形態。復合物在白光下呈藍色，在熒光顯微鏡綠光下呈鮮紅色，靈敏度很高，不易淬滅，易于長期保存，但該方法不能復染[12]。

2光學相干斷層成像技術

裂隙燈觀察CNV是一種常見的、十分簡便的方法，能夠對活體CNV的生長狀況進行初步觀察和粗略判斷，在實驗動物建模期間可以經常使用這種方法以觀察角膜的各個部位。但涉及精細觀察和準確判斷時，不得不提到OCT[13]。角膜是無色透明介質，利用相干光進行檢測，光線容易進入角膜。在眼科應用該技術，可為我們提供有價值的信息。其最大的優點在于能夠快速、非侵入式[14]地評估CNV，還可以獲得血流量、血管面積等重要數據。相比熒光素染色，這種無需使用造影劑的方法簡單快捷、分辨率高、診斷精確，還能無創傷地追蹤觀察。OTC技術于1991年被提出[15]，對眼科診斷有著革命性的促進作用，在未來有很大發展空間。

3墨汁灌注

大鼠在深麻醉狀況下，向左心室或主動脈注入生理鹽水使得CNV褪色[16]，再注入明膠-印度墨汁-生理鹽水混合成的色膠灌注新生血管[17-18]，并用液氮迅速冷卻眼球或放入冰箱冷凍，分離角膜后在其周圍做切口使角膜變平，此方法能非常直觀地顯示出血管輪廓，可用圖像分析軟件對血管的面積進行測量，從而獲得精確的數據。從最開始易于褪色的單純墨汁染色到現在加入明膠固定，該方法經過多年改進日趨完善，有價格低廉、操作簡便、重復性高等優點。但是其顯影效果受到灌注方法、溫度、壓強等因素影響，并且一些細小的血管可能沒有灌注完全，適用于批量處理死亡的實驗動物。

4免疫組織化學染色

雖然HE染色方法在過去幾十年里得到了廣泛的應用，能在一定程度上對CNV進行基礎的觀察，但是難以滿足對研究的精細測量需求。而免疫組織化學染色具有高靈敏度、強特異性和準確定位的優勢，能對CNV情況進行定性定量的觀察。目前，顯示血管內皮細胞的抗體種類繁多[19]，較為常用的主要抗體有CD31、CD34、Ⅷ因子等，然而它們并未完全顯示所有微血管，并且在不同文獻中報道的標記范圍和標記效應存在差異[20-22]。

4.1血管內皮生長因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)能夠刺激血管的增生，促進血管內皮細胞生成，并在CNV內皮細胞中強烈表達。已經有研究表明[23-25]，VEGF在CNV中可以被免疫組織化學染色法檢查出來，可見血管的管腔樣結構，陽性組織中可見棕黃色顆粒，但部分炎性細胞也呈陽性。

4.2 CD31微血管的標記和血管密度的測量也可利用CD31進行顯影[26]。CD31是血小板內皮細胞黏附分子，它可以在新生成的以及正常組織的血管內皮細胞中表達，是常見的標記物。血管內皮出現棕色顆粒作為陽性染色標準。與Ⅷ因子比較，其能更清楚地顯示微小的新生血管[27-28]。但是CD31特異性并不是很高，也會對組織中的基質細胞等染色，影響實驗結果。

4.3 CD34CD34是由糖蛋白組成的抗原，在多種細胞表面均可表達，包括基質細胞、上皮細胞、造血細胞和內皮細胞。它不僅在微血管內皮細胞中表達，而且在正常血管甚至大血管中表達。因此抗CD34染色能較為理想地顯示微小的、新生的、不成熟的血管和原先存在的大血管[29]。CD34是內皮細胞分化的高度敏感性標志物，抗CD34對新生內皮染色較正常內皮細胞更深。CD34具有背景染色清晰、輪廓明顯、對比度高等優點，其被認為是重復性最理想的內皮標記物[30]。

4.4 CD105CD105相比于CD34和CD31，其更為穩定，也有更高的特異性，但CD34和CD31對正常微血管系統染色效果較好[31]。CD105對成熟血管具有弱親和力，通常低表達或無表達，但在增殖的內皮細胞中高度表達。因此，它被認為是血管生成的可靠標志物[32]。研究表明，CD105是染色新生血管的理想選擇，但不適用于正常的微血管反應[33]。

4.5 Ⅷ因子Ⅷ因子是一種正常組織血管內皮細胞中非常重要的凝血蛋白，參與體內血液凝固，常用來標記新生的血管內皮[34-35]。Jason等研究中發現，CNV內皮細胞能產生Ⅷ因子，并且染色效果良好[36-37]。

4.6 Weibel-Palade小體Weibel-Palade小體(Weibel-Palade body，WPB)是內皮細胞的細胞器，對正常止血和炎癥反應至關重要。它的主要成分蛋白是血管性血友病因子[38](Von Willebrand，vWF)，vWF是一種多聚體蛋白，能參與凝血，在內皮細胞、血小板和巨核細胞中表達。

4.7 JG-12染色JG-12僅由血管內皮細胞合成，是一種小鼠抗大鼠氨肽酶P的單克隆抗體，能高效地檢測和定位血管內皮[39-41]，從而特異性標記CNV，毛細血管內皮胞漿內可見棕黃色顆粒。

4.8 Ki67Ki67是一種核內蛋白質，與細胞有絲分裂關系密切，在除G0期外的細胞周期所有階段均有表達，現在已經成為一種被廣泛使用的增殖標記，因此可以使用Ki67免疫組織化學來檢測CNV內皮細胞增殖情況[42-43]，在陽性細胞的細胞核中可見棕黃色顆粒。

4.9巢蛋白巢蛋白(nestin)定位于細胞質，是一種中間絲蛋白，參與細胞骨架重構[44-45]。組織成熟時，巢蛋白的表達被終止。因此巢蛋白能表達于新生的以及不成熟的小血管。對于CNV的顯影，因為抗巢蛋白的抗體能特異性識別，所以使用巢蛋白抗體標記也是不錯的選擇。

5展望

CNV顯影的方法很多，其精細程度也不同。粗略觀察可以使用裂隙燈、HE染色等方法，而精細觀察可以選擇免疫熒光染色或者光學相干斷層掃描血管造影。相信隨著科技的發展，顯影方法也會不斷進步，敏感性更好、特異性更高的標志物也會不斷被發現，OCT的分辨率和穿透力也會得到進一步的提升。目前還沒有能全面顯示所有CNV的特異性標志物，本文所列舉的方法大多也同樣適用于其它新生血管。是否存在能夠特異性識別CNV的內皮細胞的標志物，各種染色方法聯合應用效果如何，怎樣才能讓CNV盡可能多地顯影，這些問題值得進一步的研究。