臺灣牛樟總DNA提取方法研究及其PCR驗證

林雪玲 鄭蓉 何天友 楊杰 鄭郁善

摘? 要：采用Biospin（Cat#BSC13S1、Cat#BSC13S1B）和“TIANGEN”（Cat#DP305-03）植物基因組DNA提取試劑盒，對臺灣牛樟總DNA的提取方法進行了研究。結果表明：Cat#BSC13S1普通試劑盒比專門提取多糖多酚植物DNA的Cat#BSC13S1B試劑盒的效果更好，且博日Cat#BSC13S1試劑盒的DNA提取效果優于天根Cat#DP305-03試劑盒。經PCR驗證，試劑盒法提取的牛樟葉總DNA可滿足后續分子生物學實驗的要求。

關鍵詞：牛樟;DNA提取;改良試劑盒法

中圖分類號 Q946.2文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）（02-03）-0007-03

Abstract：In this experiment，the modified kit was used to extract total DNA which are The Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit （Cat#BSC13S1&Cat#BSC13S1B）and the "TIANGEN" Plant Genomic DNA Extraction Kit （Cat#DP305-03）.Experimental results show that，the result of DNA extracting by Cat#BSC13S1 is better than Cat#BSC13S1B and Cat#DP305-03.PCR amplification indicated that the total DNA could be used for subsequent molecular biology studies.

Key words：Cinnamomum kanehirae Hay;Extraction of total DNA;the modified kit

1 前言

臺灣牛樟（Cinnamomum kanehirae Hay）為臺灣特有的優質用材樹種，是一種發展潛力巨大的樹種，其樹形壯實高大，是優良的景觀樹種;其木材是家具、木雕的優質原材料;其含有的黃樟油素是重要的工業原料;其木段寄生真菌牛樟芝在治療癌癥等方面具有極高的藥用價值，被稱為“森林中的紅寶石”[1-4]。除了野生資源，也可利用牛樟椴木進行牛樟芝的人工培養，牛樟椴木培養的牛樟芝，其有效活性物質遠遠優于其他椴木培養的牛樟芝[5]。因此，近年來中國大陸各地都進行了引種研究。

近年來，隨著人們生活品質的提高和保健意識的增強，高品質牛樟芝的市場需求量越來越大，但與此同時，其專一寄主牛樟的品質及身份也需要保證[5]。目前，僅通過形態分類難以鑒別牛樟的身份，牛樟的分子鑒定技術亟待建立。從分子水平上對牛樟的基因資源及遺傳基礎進行研究，是牛樟研究的一個重要側面，而獲取高質量的總DNA是開展分子生物學研究的基礎。Huang等[6]從牛樟等3種樟屬植物中分離出15個微衛星序列，認為這些微衛星序列在3種植物中有特定的拷貝數，可用于輔助物種鑒定。由于樟科植物含有大量的多糖及次生代謝物質，給DNA的提取帶來了一定的難度。為此，筆者就牛樟DNA提取技術進行了探索，旨在尋找一種獲取牛樟總DNA較佳的途徑，為牛樟的分子生物學研究提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 材料 牛樟葉于2017年5月和11月份采自福建省龍海市九龍嶺林場的1年生植株，該牛樟系從臺灣工業技術研究院南分院引種。隨機選取若干片嫩葉，放置于塑料自封袋中，并用變色硅膠進行迅速干燥，然后將干燥的材料速帶回實驗室，于-80℃超低溫冰箱保存備用。

2.2 總DNA提取方法 采用2種方法進行DNA提取，分別為杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒法（以下簡稱“博日試劑盒法”）和“TIANGEN”植物基因組DNA提取試劑盒法（以下簡稱“天根試劑盒法”）。

2.2.1 Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（Cat#BSC13S1）法 本實驗并未完全按照說明書來操作，而是在其基礎上略作改良。主要修改的地方有以下幾點：（1）加450μLLP Buffer改成加500μl的LP Buffer。可選步驟中加入4μL的100mg/μL的RNaseA，改成加入40μL的10mg/μL的RNaseA。（2）于65℃環境中溫浴15min，將15min改成30min。（3）加入150μLDA Buffer 改成加入200μLDA Buffer。（4）第10步與第11步的“于10000xg 離心30s”改為“于10000xg離心1min”。

2.2.2 “TIANGEN”植物基因組DNA提取試劑盒（Cat#DP305-03）法 對實驗方法與藥劑用量稍作調整后進行基因組DNA的提取，具體改動步驟：將“加入液氮充分碾磨;將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700μL65℃預熱緩沖液GP1的離心管中（實驗前在預熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為1%）”改成“直接在研缽中加入1400μL65℃預熱的緩沖液GP1（先預熱再加巰基乙醇1.4μL，使其在GP1中終濃度為1%），迅速研磨，直至樣本完全液態化（水狀），用去尖的槍頭抽打混勻”。將原本的12000r全都改成13000r，離心30s改成1min。2次加入漂洗液PW的量原本都是600μL，改成第1次加入700μL，第2次加入500μL。洗脫緩沖液TE在使用前先經65～70℃水浴。

2.3 DNA質量檢測 提取的DNA以1×TAE為緩沖液，取3μL在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統觀察拍照，分析其完整性。用紫外分光光度計檢測DNA樣品的純度、濃度和完整性等。

2.4 RAPD反應 以上述提得的樣品DNA為模板，用已經篩選過的含10個堿基對的引物（表1），在Mastercycler proPCR儀上進行RAPD擴增。擴增體系為：總體積20μL，內含20ng模板DNA，0.2μmol·L-1引物，10μL的PCRMagicMix3.0。擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，37℃復性30s，72℃延伸90s，循環40次;72℃延伸8min后于4℃保存。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠于5V/cm電場中電泳60min后在凝膠成像分析儀上檢測并拍照記錄。隨機引物、PCR MagicMix3.0及其他試劑購自福州銳柏生物技術有限公司。

3 結果與分析

3.1 基因組DNA的提取 通過2種試劑盒法，從牛樟葉片中提取到基因組DNA，效果良好，濃度一般，能夠滿足后續實驗要求。2種試劑盒法相比較，博日試劑盒提取的效果優于天根試劑盒法，前者提取的DNA的條帶更加清晰明亮，DNA濃度明顯高于后者提取的結果。OD值檢測結果表明：2種方法提取的總DNA的A260/A280的比值分別處于1.61～2.10，DNA得率在24～362ng/μL，說明DNA中所包含的雜質較少，有少量的RNA殘留。許多研究學者[7-8]發現模板中的少量的RNA殘留對RAPD擴增沒有影響，因此可繼續后續實驗。博日試劑盒法完全避免了與有毒試劑（如酚、氯仿）的接觸，更加安全便捷。天根試劑盒法雖然還有巰基乙醇和氯仿的參與，但是效率比常規的CTAB方法更加快捷、方便。由于牛樟葉子富含多糖多酚物質，給DNA提取造成了一定困難，用博日試劑盒提取比較困難的一步就是抽提上清液，因為其上清粘稠度比較高，經常會將中間物質及下層液體一起吸上，從而導致DNA的提取失敗。因此，建議在使用博日試劑盒法吸取上清液的時候，采取先將混合物全部轉移至Shredder spin column這個方法。

近些年試劑盒法發展迅速，具有毒害少、效率高、操作簡單，提取質量高等優點，隨著試劑盒得率的增加，通用性的提升和價格的降低，試劑盒的應用將越來越普遍。本文所用2種試劑盒是市場上比較常見的。博日試劑盒有2種貨號，一種是Cat#BSC13S1，另一種是Cat#BSC13S1B，后者是多了一個試劑LP plus Buffer，這個試劑在說明書上說的是“若提取富含多糖多酚的植物組織，請使用LP plus Buffer”。但是，在實驗過程中發現：使用LP Buffer的效果比LP plus Buffer的效果好，DNA的濃度會相對較高，OD值也比較好。

3.2 RAPD擴增結果 用隨機選取1個符合要求的基因組DNA對共10個不同引物進行RAPD擴增的結果。每個引物對這個DNA都能擴增出清晰可辨的條帶，說明提取的DNA適于RAPD擴增分析。本實驗也發現，模板DNA中有少量的RNA殘留對RAPD擴增結果幾乎沒有影響。

4 結論與討論

一定數量及高質量的DNA樣品是進行限制性酶切、分子雜交、遺傳多態性分析、PCR擴增以及基因組學等分子生物學研究的基礎。因此，快速有效的DNA提取是成功的第一步，在DNA提取試劑盒逐漸商品化的進程中，選擇一款適用且性價比高的產品也是很重要的。

由于牛樟葉片含有大量多糖、蛋白質、葉綠素及多酚類等物質，且葉片越老、這些物質含量越高，這給牛樟DNA的提取帶來了一定難度，所以在材料選擇時盡量選擇幼嫩的葉片。常規的CTAB方法經常會有微量氯仿、CTAB、異丙醇等物質的殘留，往往會影響到RAPD擴增的結果[9]。因此，選擇試劑盒法可以避免這些藥劑的使用，使擴增更容易。本次實驗結果表明：2種方法提取的DNA都可以用于后續實驗，但是總體來說博日試劑盒法更加有效、便捷，并且完全避免了與有毒試劑的接觸，更加安全。

參考文獻

[1]官錦燕，譚嘉娜，羅劍飄，等.牛樟的組織培養和植株再生[J].南京林業大學學報（自然科學版），2016，40（4）：63-68.

[2]楊海寬，章挺，汪信東，等.牛樟葉精油化學成分分析及類型劃分研究[J].江西農業大學學報，2016，38（4）：668-673.

[3]彭真汾，王威，謝倩，等.牛樟資源保護現狀及繁育研究進展[J].亞熱帶農業研究，2016，12（1）：68-72.

[4]李亞龍，唐軍榮，楊宇明，等.牛樟組織培養技術研究[J].福建林學院學報，2017，8（8）：48-53.

[5]孟紅巖，郭鶯，林文珍，等.臺灣牛樟總RNA提取方法的建立[J].亞熱帶植物科學，2016，45（1）：53-56.

[6]H Hung-K，H Lin-C，C Shih-H，等.Development，characterization and cross-species ampli?cation of new microsatellite primers from an endemic species Cinnamomum kanehirae（Lauraceae）in Taiwan[J].Conservation Genetics Resources，2014，6（4）：911-913.

[7]馮斌，張希踔，解明，等.榛子種質資源多樣性的RAPD分析[D].大連：遼寧師范大學，2007.

[8]汪小全，鄒喻蘋，張大明，等.RAPD應用于遺傳多樣性和系統學研究中的問題[J].植物學報，1996，38（12）：954-962.

[9]劉春林，官春云，李木旬.植物RAPD標記的可靠性研究[J].生物技術通報，1999（2）：33-36.

（責編：張宏民）