右美托咪定在大鼠腦出血延遲低溫治療中的作用

梁威，彭曉紅

[武漢市第四醫院（華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院） 麻醉科，湖北 武漢 430032]

腦出血（cerebral hemorrhage,CH）是由于高血壓、腦血管畸形等引起的腦實質內血管自發破裂出血，為臨床常見的急癥之一[1]。腦出血起病突然、進展快，具有發病率高，致殘、病死率高的特點，好發于45歲以上人群。流行病學資料顯示，全球每年約有200萬人罹患腦出血，總發病率為24.6/10萬人，占全部腦卒中的15%～20%[2]，我國發病率處于世界較高水平，約為60/10萬～80/10萬，占腦卒中的21%～48%，急性期病死率高達38%～43%[3]，并且近年來有逐漸升高的趨勢，給患者和家庭造成很大痛苦。對于腦出血，目前臨床上以防止再出血及對癥治療為主，尚無特效治療方案。亞低溫是一種物理性的神經保護手段，主要通過將體溫降至32～34℃來發揮治療作用，已經有研究顯示，亞低溫治療能減輕腦出血所致的血腫和血腫周圍水腫，改善預后[4]。右美托咪定為α2-腎上腺素受體激動劑，屬于鎮靜催眠藥物，可用于腦出血術后鎮靜[5]。有研究認為，右美托咪定聯合淺低溫治療對腦缺血損傷大鼠具有神經保護作用[6]，而關于兩者聯合治療腦出血的研究較少，本研究探討右美托咪定在大鼠腦出血后延遲低溫治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠 95只，周齡為8～10周，體重300～360 g，平均（332.46±15.13）g，購自廣州醫藥研究總院有限公司，動物許可證號：SYXK（粵）2013～0003。將大鼠5只/籠分籠飼養，喂以標準飼料及消毒的自來水，自由活動與進食水，飼養室內安靜、清潔、通風，溫度在25℃左右，晝夜時間比為12 h∶12 h，定期更換清潔墊料。

1.1.2 主要藥品與試劑 鹽酸右美托咪定注射液，規格：2 ml/支，批準文號：國藥準字H20110097，四川（樂山）國瑞藥業有限責任公司；肝素鈉注射液，規格：12 500 u/支，批準文號：國藥準字H32021978，蘇州新寶制藥有限公司；2%戊巴比妥鈉、Ⅶ型膠原酶，美國Sigma公司；檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），上海信裕生物科技有限公司；TUNEL色標法細胞凋亡檢測試劑盒，美國ScienCell公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白細胞介素 8（interleukin 8,IL-8）、神經元烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）、S100β蛋白（S100β）ELISA試劑盒，無錫東林科技發展有限責任公司。Ⅶ型膠原酶溶于滅菌生理鹽水中，制備濃度為1 u/μl的Ⅶ型膠原酶溶液，置入-20℃冰箱冷凍保存。

1.1.3 主要儀器設備 大鼠腦立體定位儀（上海玉研科學儀器有限公司），微量進樣器（武漢賽維爾生物科技有限公司），GTR10-1型低溫離心機（北京時代北利離心機有限公司），EP220A電子天平（瑞士Precisa公司），DM3000熒光顯微鏡（德國Leica公司），Freedom EVOlyzer?全自動酶免分析儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 復制模型及實驗方法 經過為期 1 周的適應性飼養后，將大鼠隨機分為假手術組19只和手術組76只，手術組又分為模型組、延遲低溫組、右美托咪定組、右美托咪定聯合延遲低溫組，每組19只。手術組采用立體定向尾狀核注射法復制腦出血模型，復制模型前8 h禁食水，稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.1 ml/kg以麻醉大鼠，右美托咪定組和右美托咪定聯合延遲低溫組給予鹽酸右美托咪定注射液100 μg/kg腹腔注射，假手術組、模型組、延遲低溫組給予等量生理鹽水腹腔注射；之后將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部備皮、消毒，于眼耳之間正中作一長度為1.5～2.0 cm的矢狀切口，暴露顱骨，采用牙科鉆在前囟前0.2 mm，中線右側旁開3.0 mm處鉆孔，暴露硬腦膜；采用微量進樣器吸取0.26 μl Ⅶ型膠原酶和肝素混合液（0.5 μl Ⅶ型膠原酶 +0.5 μl肝素），沿骨孔垂直進針5.0 mm緩慢注射，留針10 min后退出，常規清潔、消毒、縫合傷口，待大鼠蘇醒放回籠中飼養[7]。術后2 h，大鼠Berderson神經癥狀評分[8]等級為1～3級，即為模型復制成功，過程中若有大鼠意外死亡或復制失敗，則取備用大鼠補充；假手術組手術操作方式與手術組相同，但不向顱內注射藥物。術畢12 h，將延遲低溫組、右美托咪定聯合延遲低溫組大鼠間斷置于5℃養育箱內飼養12 h，保持大鼠肛溫為32～34℃，模型組、假手術組、右美托咪定組大鼠置于25℃養育箱內飼養12 h。

1.2.2 神經功能缺損程度量表（neurological deficit score,NDS）評分 復制大鼠腦出血模型 48 h 后，從自發性轉圈、后肢回縮、雙側前爪抓握、雙側前肢屈曲、橫梁行走5個方面對大鼠的神經功能進行評價，每個方面根據嚴重程度不同分值為0～3分，總分為0～15分，得分越高，提示神經功能缺損越嚴重[9]。

1.2.3 標本采集與處理 NDS 評分測定結束后，腹腔注射2 %戊巴比妥鈉0.1 ml/kg麻醉大鼠，采用斷頭法取血 3 ml，置于離心管內，在 4℃、3 000 r/min 離心10 min，獲得血清，置于-20℃冰箱保存；打開顱骨取腦，自中線切開，切取血腫周圍腦組織，其中1/2用于腦組織水分含量檢測；剩余1/2腦組織采用10%中性緩沖甲醛固定液固定、梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備厚度為4 μm的組織切片備檢。

1.2.4 腦組織水分含量檢測 將取出的 1/2 血腫周圍腦組織進行沖洗及吸干表面水分，稱量濕重（g），之后置于60℃烤箱內烘干，48 h后重量恒定時稱量干重（g），根據腦組織水分含量=（濕重-干重）/濕重×100%進行計算。

1.2.5 TUNEL 法檢測血腫周圍腦組織細胞凋亡 取出腦組織石蠟切片，采用二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，將切片置于0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，微波高檔煮沸10 min進行抗原修復，按照TUNEL色標法細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行染色，常規封片，采用熒光顯微鏡觀察切片，在高倍鏡（×400）下，隨機選取5個不重復視野，計數TUNE染色陽性細胞核（呈棕褐色）個數以及細胞核總數，根據凋亡指數=陽性細胞數/細胞總數，計算細胞凋亡指數。

1.2.6 血清炎癥細胞因子和腦損傷標志物水平檢測取出大鼠血清，采用Freedom EVOlyzer ?全自動酶免分析儀，依據ELISA試劑盒說明書步驟進行操作，檢測血清TNF-α、IL-8、NSE、S100β水平。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，方差齊用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠NDS評分及腦組織水分含量比較

5組大鼠NDS評分及腦組織水分含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，手術各組大鼠NDS評分及腦組織水分含量與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），手術各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯合延遲低溫組大鼠NDS評分及腦組織水分含量較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯合延遲低溫組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組。見表1。

表1 各組大鼠NDS評分及腦組織水分含量比較（n=19，±s）

表1 各組大鼠NDS評分及腦組織水分含量比較（n=19，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 NDS評分 腦組織水分含量/%假手術組 1.37±0.17 62.45±7.32模型組 10.53±1.381） 86.56±9.21延遲低溫組 7.31±0.791）2） 75.84±8.041）2）右美托咪定組 7.26±0.831）2） 75.43±8.271）2）右美托咪定聯合延遲低溫組 4.57±0.621）2）3）4） 67.36±5.471）2）3）4）F值 308.037 26.761 P值 0.000 0.000

2.2 各組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數比較

5組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，手術各組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），手術各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯合延遲低溫組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數較低，且延遲低溫組和右美托咪定組的凋亡指數與右美托咪定聯合延遲低溫組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均大于右美托咪定聯合延遲低溫組。見表2和附圖。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較

5組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，手術各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），手術各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯合延遲低溫組大鼠血清TNF-α、IL-8水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯合延遲低溫組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組。見表3。

表2 各組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數比較（n=19，±s）

表2 各組大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡指數比較（n=19，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 凋亡指數假手術組 1.19±0.15模型組 27.45±3.021）延遲低溫組 17.87±2.081）2）右美托咪定組 17.56±2.241）2）右美托咪定聯合延遲低溫組 10.94±1.361）2）3）4）F值 440.271 P值 0.000

附圖 血腫周圍腦組織細胞凋亡情況 （TUNEL×400）

2.4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較

5組大鼠血清NSE、S100β水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，手術各組大鼠血清NSE、S100β水平與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），手術各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組和右美托咪定聯合延遲低溫組大鼠血清NSE、S100β水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯合延遲低溫組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組。見表4。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較（n=19，mg/dl，±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較（n=19，mg/dl，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 TNF-α IL-8假手術組 0.45±0.06 0.16±0.02模型組 0.98±0.141） 0.87±0.121）延遲低溫組 0.86±0.091）2） 0.68±0.061）2）右美托咪定組 0.81±0.111）2） 0.62±0.071）2）右美托咪定聯合延遲低溫組 0.67±0.081）2）3）4） 0.33±0.041）2）3）4）F值 78.652 308.159 P值 0.000 0.000

表4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較（n=19，±s）

表4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較（n=19，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 NSE/（μg/L） S100β/（mg/dl）假手術組 6.36±0.85 1.65±0.21模型組 26.44±3.121） 10.88±1.371）延遲低溫組 20.75±2.241）2） 7.83±1.111）2）右美托咪定組 20.48±2.321）2） 7.26±1.031）2）右美托咪定聯合延遲低溫組 14.08±1.941）2）3）4） 4.91±0.641）2）3）4）F值 226.776 244.410 P值 0.000 0.000

3 討論

腦出血是導致人類死亡的三大主要原因之一，常見的病因有高血壓伴小動脈硬化、微動脈瘤、煙霧病、顱內靜脈血栓形成、血栓性血小板減少癥等，氣候變化、情緒激動、用力過猛等因素也可誘發。腦出血后繼發的血腫周圍水腫是患者病情進展的主要原因之一，包括血管源性水腫、細胞毒性水腫兩種類型。血管源性水腫與血腦屏障受損、組織間隙身份增多有關，細胞毒性水腫則與細胞膜結構由于缺血、缺氧、中毒受損有關，血腫占位壓迫、中樞神經系統炎癥反應、凝血級聯反應等均參與血腫形成過程，加重腦組織損傷[10]。在腦出血的治療中，及時有效地控制腦水腫是改善治療效果的關鍵。亞低溫治療由BUSTO于1987年提出，是應用于腦卒中和顱腦損傷的腦保護手段，該治療方式能夠降低腦代謝率、改善腦血流循環、保護血腦屏障、抑制氧自由基、炎癥因子、興奮性氨基酸等內源性物質對腦細胞的損害作用、調控基因表達減少神經元凋亡等，起到神經保護作用[11]。延遲低溫治療多于腦出血后12 h開始，此時既能減輕血腫相關損傷，又避免血壓升高、凝血功能異常等并發癥影響治療效果[12]。右美托咪定為鎮靜催眠藥物，也具有神經保護作用，其作用可能通過抑制兒茶酚胺釋放、營養神經、抗氧化、抑制神經元凋亡、抑制神經炎癥反應、激活咪唑啉Ⅰ受體等機制體現出來[13]。已有研究認為，右美托咪定有通過調節血腫周圍腦組織Bcl-2/Bax表達，抑制腦出血大鼠腦組織細胞凋亡的作用[14]。

本研究采用立體定向尾狀核注射法復制大鼠腦出血模型，并分別采用延遲亞低溫療法、右美托咪定腹腔注射進行干預，結果顯示，與模型組比較，各組大鼠NDS評分、腦組織水分含量、血腫周圍腦組織細胞凋亡指數較低，且延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組，表明延遲低溫治療聯合右美托咪定能夠更有效地抑制大鼠腦出血后繼發的血腫周圍腦水腫，減少腦細胞凋亡，減輕神經功能缺損程度，有利于預后的改善。

腦出血后釋放的炎癥細胞因子在繼發性腦水腫的發生過程中起到關鍵作用。TNF-α為炎癥反應中的神經毒介質，由多種細胞分泌，其水平與血腫周圍水腫體積呈正相關性，可預測水腫嚴重程度[15]，還能誘導趨化因子釋放；IL-8屬于中性粒細胞趨化因子，可以促進炎癥細胞聚集、黏附，引發局部炎癥反應，刺激氧自由基等有害介質釋放，使得神經細胞和血腦屏障受損，誘發腦組織水腫。本研究顯示，與模型組比較，各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平較低，且延遲低溫組、右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組，表明左美托咪定能協助延遲低溫治療降低腦出血大鼠血清炎癥細胞因子水平，減輕腦出血誘發的炎癥反應，緩解炎癥細胞因子介導的腦水腫和組織損傷。

神經元損傷是腦出血后神經功能缺損的根本原因。NSE主要存在于中樞神經元胞漿內、能夠起到營養神經元及神經保護作用，神經元受損時，NSE被釋放，經血腦屏障進入血液，導致其血液含量增加，血液NSE水平與腦出血的出血量正相關，可用來評價腦損傷程度及預測預后[16]。S100β也是神經生化標志物，由活化的星形膠質細胞分泌，參與神經元生長、再生、修復過程，血中S100β過多可加重腦水腫，其血清水平升高也與神經元損傷有關。本研究結果顯示，與模型組比較，各組大鼠血清NSE、S100β水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯合延遲低溫組，表明右美托咪定能提高延遲低溫治療對腦出血大鼠腦組織的保護作用，有效減輕腦損傷程度。

綜上所述，右美托咪定能夠提高延遲低溫治療對大鼠腦出血的治療效果，有效改善神經功能缺損，減輕腦組織水腫，抑制腦細胞凋亡，減輕相關炎癥反應和腦損傷程度。