狼瘡抗凝物檢測的性能驗證及大連地區參考區間建立

靳 巖，袁曉陽

(大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧大連 116011)

狼瘡抗凝物(LA)是抗磷脂抗體家族成員之一，是病理性循環抗凝物[1]。在疑似抗磷脂綜合征或不明原因活化部分凝血活酶時間延長時可檢測LA，近幾年極受臨床醫生關注。稀釋蝰蛇毒時間(DRVVT)法是LA最佳檢測方法[2]，但此方法的性能驗證和參考區間建立國內鮮有報道，本文對DRVVT法檢測LA做性能評估，并建立大連地區參考區間，為開展或計劃開展此項目的實驗室提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次實驗采用的樣本均為2018年6-8月在大連醫科大學附屬第一醫院體檢的體檢健康者和就診的科室患者。1∶9枸櫞酸鈉抗凝(3.2%) 靜脈血樣本3 000 r/min離心10 min，2次，樣本采集后2 h內完成上機檢測。

1.2儀器與試劑 用于LA檢測的CS-5100全自動血凝儀由日本希森美康公司提供，DRVVT篩選、確證試劑及質控品均為原廠配套試劑，由西門子公司提供。

1.3性能驗證

1.3.1精密度 日內精密度：根據ISO15189評審文件制定過程中參考的其中一項文件，即美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)EP15文件[3],要求取健康人混合樣本和高值混合樣本，每個樣本連續測20次，計算標準差(SD) 和變異系數(CV%) ,與文件要求比較。日間精密度正常水平： 取同一批號正常水平質控品，用同一批號試劑每天測定一次，連續測定20 d，計算SD和CV%;異常水平：取異常混合樣本分裝EP管，-40 ℃冰凍保存，使用前37 ℃速溶，用同一批號試劑每天測定一次，連續測定20 d，計算SD和CV%，與文件要求比較。

1.3.2準確性 取正常水平質控品檢測LA1、LA2并計算比值，連續測定3次，計算均值，與說明書給定靶值比較，偏差=(測定均值-質控品定值)/質控品定值×% ，與文件要求比較。

1.3.3攜帶污染率 異常樣本對正常樣本污染:取LA比值正常水平樣本(N)放樣本架1號和3號位置，異常水平樣本(A)放2號位置。每個樣本分別測3次，結果為N1、N2、N3、A1、A2、A3、N4、N5、N6，攜帶污染率K1=[N4-Mean(N1,N2,N3)]/Mean(N1,N2,N3)。正常樣本對異常樣本污染:取LA比值異常水平樣本(A)放在樣本架1號和3號位置，正常水平樣本(N)放在2號位置，每個樣本分別測3次，結果為A1、A2、A3、N1、N2、N3、A4、A5、A6,攜帶污染率K2=[A4-Mean(A1,A2,A3)]/Mean(A1,A2,A3),K≤10%為合格。

1.3.4試劑更換批號比對 取LA比值正常樣本3例，異常樣本2例，分別用新舊兩個批號檢測LA比值，計算偏差,偏差=(新批號測定值-舊批號測定值)/舊批號測定值×% ，與文件要求比較。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件和Excel統計軟件進行分析。

2 結 果

2.1日內及日間精密度CV%遠遠小于試劑說明書給定標準(正常值樣本CV%≤5.00%，異常樣本CV%≤10.00%)，也在實驗室ISO15189文件允許范圍內。結果見表1。

2.2準確性驗證 準確性驗證用定值質控品驗證，與1/2CIA′88室間質評要求比較合格。結果見表2。

2.3攜帶污染率 攜帶污染率驗證合格。遠遠低于實驗室ISO15189文件要求。結果見表3。

表1 DRVVT精密度驗證表

表2 DRVVT準確性驗證表(正常水平)

表3 DRVVT攜帶污染率驗證表

2.4試劑更換批號比對 5個樣本偏差均小于1/2CIA′88室間質評要求，符合ISO15189文件標準。結果見表4。

表4 DRVVT試劑更換批號比對驗證表(比值)

2.5參考區間建立 本實驗參考區間與試劑說明書有差異，LA比值臨界值(1.22)高于試劑說明書(1.20)，充分證明了自建參考區間的重要性。結果見表5。

表5 DRVVT參考區間建立

3 討 論

LA持續存在常見于抗磷脂抗體綜合征、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，與患者動靜脈栓塞、病態妊娠風險密切相關[5]。有報道在妊娠晚期聯合應用LA和其他凝血指標，可進一步提高對血栓形成事件風險評估的準確率[6]，且自身免疫性疾病LA陽性患者血栓形成概率明顯高于陰性組[7]，檢測LA不僅可以預防血栓發生，還可以預測治療后血栓好轉情況[8]，對臨床各科的疾病診斷有很大意義。最新指南指出，一個LA檢測完整實驗項目至少包括篩查和確證試驗，結果以LA1與LA2比值方式報告。西門子公司提供兩個完整的檢測項目，LA1 篩選試驗，LA2確證試驗，滿足國際血栓與止血學會委員會發布的針對 LA檢測標準。自2003年《醫學實驗室質量和管理》要求(ISO15189：2003)發布以來，國內有100多家醫學實驗室通過認可[9]，本實驗室在2013年就通過了評審。按ISO15189醫學實驗室認可：2007要求[10]，實驗室新開展項目要進行性能驗證，目前血栓與止血特殊項目性能驗證沒有標準，本實驗按凝血普通項目標準來驗證,日內精密度、正常和異常樣本CV%均≤2.00%，日間精密度、正常水平為西門子廠家質控品，CV%≤5.00%，由于該廠家沒有異常水平質控品，異常水平日間精密度采用異常混合樣本代替，CV%≤5.00%。準確性與定值質控值相比偏差≤7.50%。攜帶污染率驗證，LA比值正常樣本對異常樣本污染為0，異常樣本對正常樣本污染僅為-0.92，遠遠小于ISO15189文件規定≤10.00%標準，試劑更換批號比對偏差均≤7.50% 。所做性能驗證都能符合ISO15189要求，說明DRVVT試驗可以適用于臨床，但因為DRVVT試驗原衛生部沒有開展室間質評，沒有做正確度驗證，有待進一步完善驗證。

4 結 論

使用DRVVT檢測LA有良好性能，可以用此方法檢測狼瘡抗凝物的存在，但說明書給定的參考區間有待于驗證，必要時建立實驗室自己的參考區間，使檢驗結果更精準，更好地為患者服務。