APN、MMP-9、PLGF的表達水平與重度子癇前期發病的關系研究

蔣 韜,潘建海

(湖北醫藥學院附屬隨州醫院婦產科,湖北隨州 441300)

子癇前期是指妊娠期對母嬰均造成危害的特發疾病，孕婦在妊娠20周后，表現出血壓升高、尿蛋白增加、水腫以及器官損傷[1]。子癇前期發病機制復雜，目前研究認為其發病原因可能與異常血管重鑄、血管內皮細胞功能異常、脂代謝紊亂等有關[2]。脂聯素(APN)是由成熟脂肪細胞分泌的蛋白，具有抗炎，改善胰島素抵抗，保護血管內皮等作用[3]。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種可消化細胞外基質的蛋白水解酶，與滋養細胞侵襲力、重建螺旋動脈有關[4]。胎盤生長因子(PLGF)具有促進滋養細胞和內皮細胞增殖作用[5]。結合子癇前期發病機制，認為APN、MMP-9和PLGF可能參與子癇前期發病。本研究旨在分析胎盤組織中APN、MMP-9和PLGF表達水平，探討其與重度子癇前期發病的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年4月至2017年3月在本院住院分娩的重度子癇前期孕婦110例為觀察組，觀察組患者均符合重度子癇前期診斷標準[6]，排除伴有產科其他并發證以及有原發病患者。另選取同期在本院住院分娩110例血壓正常孕婦為對照組。兩組孕婦在年齡、孕次以及產次方面，差異無統計學意義(P>0.05)，孕婦體質量指數(BMI)以及新生兒體質量方面差異有統計學意義(P<0.05)，一般資料見表1。兩組患者均知情同意，本研究經本院倫理委員會批準同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2標本收集 胎盤娩出后，立刻在胎盤中心取一小塊胎盤組織，注意避開肉眼可見壞死處和鈣化處。生理鹽水洗凈后，將其分為兩部分，一部分迅速采用10%甲醛溶液浸泡，然后石蠟包埋，待行免疫組化檢測；另一部分迅速置入液氮罐內，隨后轉入-80 ℃冰箱，待行熒光定量PCR檢測。

1.3熒光定量PCR檢測方法 胎盤組織經Trizol溶液(北京康為世紀生物科技有限公司)裂解后，采用總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取胎盤組織RNA，提取步驟參照試劑盒說明書。然后參照SuperRT cDNA 試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)說明書步驟進行反轉錄。熒光定量PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。熒光定量PCR反應體系20.0 μL∶2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,DNA模板0.8 μL，RNase-Free Water補足20.0 μL。熒光定量PCR反應條件：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s重復40個循環，最后升溫至95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣本至少設置3個重復孔。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.4免疫組化檢測方法 將石蠟標本切片，厚度約為5 μm，常規脫蠟水化，采用3% 過氧化氫封閉10 min后，微波修復抗原。然后采用5%牛血清清蛋白(BSA)封閉30 min，加單克隆抗體(一抗)低溫孵育過夜。次日，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次后，加入羊抗鼠二抗、SABC室溫孵育30 min，PBS清洗3～5次后，進行DAB顯色。復染1 min后脫水、透明、封片。采用Olympusix-71倒置熒光顯微鏡(日本)觀察，細胞質或者細胞核呈棕黃色視作陽性表達。在400倍鏡下取5個視野，采用MPIAS-500計算機圖像分析處理系統進行積分光密度分析。

2 結 果

2.1兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF mRNA 表達比較 觀察組胎盤組織APN mRNA表達顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組胎盤組織MMP-9和PLGF mRNA表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF mRNA 表達比較

2.2兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF蛋白表達比較 觀察組胎盤組織APN蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，觀察組胎盤組織MMP-9和PLGF 蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 兩組胎盤組織APN、MMP-9和PLGF蛋白表達比較

表5 胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA、 PLGF mRNA等相關性分析

2.3相關性分析 胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA、PLGF mRNA和新生兒體質量呈負相關，與孕婦BMI呈正相關，見表5。胎盤組織MMP-9 mRNA與PLGF mRNA和新生兒體質量呈正相關，與孕婦BMI呈負相關，見表6。胎盤組織PLGF mRNA與新生兒體質量呈正相關，與孕婦BMI呈負相關，見表7。APN、MMP-9、PLGF的mRNA均與年齡無關。

表6 胎盤組織MMP-9 mRNA與PLGF mRNA等相關性分析

表7 胎盤組織PLGF mRNA與年齡等相關性分析

3 討 論

子癇前期是妊娠期女性以高血壓和蛋白尿為主要特征的內科疾病，其發病是因胎盤血流灌注不足所引起。胎盤絨毛滋養細胞受損，侵襲能力減弱，子癇前期中子宮螺旋動脈被限制于子宮蛻膜層表面，導致部分血管重鑄失敗，胎盤灌注減少，出現缺血缺氧現象，影響胎兒發育。同時滋養細胞分泌的大量細胞因子進入母體血液循環系統，導致內皮功能損傷，從而引發子癇前期臨床癥狀[7]。

APN是由成熟脂肪細胞分泌的具有多種生物活性的蛋白質，通過與AdipoR1和AdipoR2兩種跨膜轉運受體相互作用而發揮作用，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗栓、抗氧化作用，并可參與機體代謝、骨生成、抗腫瘤過程。另外，APN可促進NO合成，有助于子癇前期孕婦血壓調節以及血管功能保護[8-9]。MMP是一組可將細胞外基質降解的內切酶，與胎盤形成和子宮螺旋動脈重構密切相關，MMP-9即明膠酶B，可選擇性浸潤子宮內膜，利于胎盤著床，是胎盤形成最重要的因子之一[10]。且有研究表明，MMP-9與滋養細胞侵襲力以及血管生成有關[11]。PLGF是血管內皮生長因子(VEGF)家族中的一員，包含PLGF-1、PLGF-2、PLGF-3、PLGF-4共4個亞型，前兩者是發揮生理效應的主要亞型。PLGF可促進滋養細胞增殖、遷移，抑制滋養細胞凋亡，同時增強VEGF活性，促進NO釋放，有助于胎盤生長[12]。由于APN、MMP-9和PLGF均與滋養細胞功能調節或血管內皮細胞功能調節相關，所以推測他們可能參與子癇前期的發生。

本研究對重度子癇前期孕婦以及健康孕婦胎盤組織中APN、MMP-9和PLGF的表達水平分別采用熒光定量PCR和免疫組化方法進行檢測，結果發現，觀察組APN在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著高于對照組，觀察組MMP-9、PLGF在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著低于對照組，提示重度子癇前期孕婦胎盤組織APN表達量增多，而MMP-9、PLGF表達量降低。APN表達量升高可能是對患者機體抗血管生成、代謝變化以及炎性反應的補償性反饋調節，與李園園[13]研究結果一致。但另有研究結果顯示，APN表達量在重度子癇前期孕婦胎盤組織內明顯降低[14]，造成結果差異的原因可能與各研究檢測未區分APN亞型，而不同亞型間活性差異較大有關。MMP-9表達量降低會直接影響滋養細胞侵入以及子宮螺旋動脈重鑄，導致胎盤血流灌注不足，滋養細胞因缺血缺氧釋放有害因子，致使血管內皮損傷，出現細小動脈痙攣等癥狀，與辛樂等[15]研究結果一致。PLGF表達量降低則使滋養細胞和內皮細胞增殖分化能力降低，從而減少胎盤血管形成，進一步損傷血管內膜。同時PLGF表達量降低還會破環血管舒縮因子平衡，使細小動脈發生痙攣，胎盤缺血缺氧愈發嚴重，與楊麗萍等[16]對血清中PLGF檢測結果一致。

本研究通過相關性分析發現，胎盤組織APN mRNA與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA均呈負相關，推測APN升高和MMP-9、PLGF降低對血管生成平衡造成影響，使血管內皮細胞受到損傷，共同參與重度子癇前期的發生和發展。而MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈正相關，提示兩者在重度子癇前期發病中具有協同作用。孕婦BMI與APN mRNA呈正相關，與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈負相關，說明孕婦肥胖程度會影響子癇前期的發生，這可能與炎性反應、氧化應激等有關。新生兒體質量與APN mRNA呈負相關，與MMP-9 mRNA和PLGF mRNA呈正相關，說明抗血管生成因子和促血管生成因子平衡失常等信號經胎盤屏障傳達到胎兒，使胎兒生長發育受到影響，但具體機制還需進一步探討。

4 結 論

重度子癇前期孕婦胎盤組織中APN表達升高，MMP-9和PLGF表達降低，三者可能通過影響血管生成平衡引起重度子癇前期發生，且新生兒體質量與APN、MMP-9和PLGF相關，三者可能通過胎盤屏障對胎兒發育進行調控。