非肌型絲切蛋白基因表達水平與慢性粒細胞白血病患者預后的關系分析

王 靜，袁玉軍

(公安縣人民醫院檢驗科，湖北荊州 434300)

慢性粒細胞白血病(CML)系發生于造血干細胞的惡性克隆性疾病，BCR-ABL融合基因為其發病的關鍵啟動基因，其編碼P210蛋白活化可激活酪氨酸激酶活性，影響下游信號通路調控，干擾纖維狀肌動蛋白(F-actin)功能，降低細胞對基質反應性，影響細胞凋亡及黏附過程[1]。在大部分非肌細胞內，F-actin均為動態結構，其處于持續解聚過程以維持細胞形態，非肌型絲切蛋白(CFL1)則為肌動蛋白解聚因子的重要成員，系存在于真核生物體內的一類肌動蛋白結合蛋白，其可通過與肌動蛋白發生解聚促進肌動蛋白纖維能循環應用，確保肌動蛋白纖維快速聚合、解聚，影響細胞及其外基質黏附，促進細胞運動、遷移、分裂及凋亡[2]。絲切蛋白其活性受到磷酸肌醇、肌球蛋白、去磷酸化等多因素影響，對細胞內信號轉導、肌動蛋白骨架重組均存在一定程度的影響，可促進惡性腫瘤侵襲及轉移[3]。但目前CFL1在CML發病中的作用及對患者預后的影響，筆者查閱文獻發現尚未見報道?；诖?，為探討CFL1與CML預后的關系，現對本院收治的70例初發CML患者的臨床資料進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用回顧性研究，收集2011年2月至2013年4月本院收治的70例初發CML患者的臨床資料作為CML組。納入標準：均符合血液病診斷及療效標準中CML相關診斷標準[4]，且為初發患者，處于疾病緩解期；入院后均接受伊馬替尼治療；病例資料完善，有明確初診、治療后骨髓標本，有明確CFL1監測數據；臨床及隨訪資料完整。排除標準：合并嚴重心、肝、腎、肺器質性功能障礙者；合并嚴重精神疾病者；合并其他惡性腫瘤者；其他類型白血病者；臨床及隨訪資料不完整者。選擇同期來本院體檢的40例健康體檢者作為對照組。對照組均體檢健康者，入院后均留取外周血樣本，均無血液病家族史。CML組與對照組性別、年齡、體質量等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 CML患者與健康者一般資料比較

1.2材料、主要試劑與儀器 標本：CML患者及健康者標本均來源于醫院血液科及體檢中心。試劑：Trizol抽提試劑、逆轉錄酶、Taq DNA合成酶、緩沖液(美國天根公司)，淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，CFL1及內參GAPDH引物設計及合成(上海生工生物工程公司)，SYBR green(大連Takara公司)。儀器：冰凍高速離心機(德國Heraeus公司)，臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，微量DNA定量儀(美國Thermo公司)，制冰機(美國Sigma公司)，熒光分析儀(美國Bio-Rad公司)，DNA擴增儀(美國PE公司)，紫外分光光度計(北京普析通用儀器公司)。

1.3方法 所有CML患者均接受伊馬替尼(瑞士 Novartis Pharma Schweiz AG生產，批號H20100263)口服治療，400 mg/d，治療期間均監測細胞學、血液學等指標的改善，并調整治療劑量。治療前CML患者均收集骨髓4 mL，淋巴細胞液分離骨髓單個核細胞，健康者入院后收集外周血4 mL，均經淋巴細胞分離液分離單個核細胞，-80 ℃低溫保存，加入含20%胎牛血清培養基培養24 h，制備染色體，檢查染色體核型。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行實時定量PCR反應，CFL1引物序列，上游：GCG TAA GTC TTC AAC GCC AGA G，下游：TCG ACA GTC TGG CCC ACA TC；內參GAPDH引物序列，上游：ATG GGG AAG GTG AAG GTC G；下游：GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA TC。PCR反應體系共25 μL，包括2×SYBR@Premix EX TaqTMⅡ12.5 μL+內參基因+上下游引物0.4 μmol+cDNA模板1 μL+焦碳酸二乙酯(DEPC)純化水。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環，觀察熒光信號及溶解曲線，PCR產物加入5∶16×緩沖液，加樣2%瓊脂糖凝膠，電泳，紫外分光光度儀下觀察條帶位置，進行PCR擴增，反應結束后，任意選擇4～5個陽性模板進行標準梯度點分析，決定系數(r2)>0.97，提示線性關系良好，確定定量標準曲線，并獲取熒光定量反應絕對值為目的基因表達水平。收集所有患者人口學資料、外周血白細胞計數、嗜酸性粒細胞計數、骨髓象、Ph染色及隨訪情況。

1.4隨訪情況 所有患者均隨訪至2017年4月，研究終點：總生存(OS)表示自確診CML至死亡；無事件生存(EFS)表示自確診CML后出現以下事件(喪失完全遺傳學反應、停藥、疾病進展、任何原因所致死亡)為止；無進展生存(PFS)表示自確診CML至疾病加速、急變或其他原因所引起死亡為止。同一事件多次發生則以首次發生事件為準。

2 結 果

2.1CML患者與對照組CFL1表達比較 CML組CFL1表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 CML患者與對照組CFL1表達比較

2.2疾病轉歸情況 70例CML患者隨訪12～48個月，平均(37.5±1.3)個月，隨訪結束存活44例(62.86%)，死亡26例(37.14%)。死亡組的年齡≥50歲、白細胞計數≥50×109/L、血小板計數<100×109/L或>700×109/L、外周血原始細胞百分比≥3%、Ph染色體陰性、骨髓原始細胞百分比≥5%所占比例均高于存活組(P<0.05)，其CFL1表達水平低于存活組(P<0.05)，見表3。

表3 不同預后CML患者臨床資料比較

續表3 不同預后CML患者臨床資料比較

2.3CML患者預后Cox模型回歸分析 Cox回歸分析顯示,年齡≥50歲、白細胞計數≥50×109/L、血小板計數<100×109/L或>700×109/L、Ph染色體陰性、骨髓原始細胞百分比≥5%、低CFL1表達水平均不利于CML患者遠期生存，均為影響其預后的相關因素，其中Ph染色體陰性危險度最高，其次為白細胞計數≥50×109/L、低CFL1表達水平，見表4。

表4 CML患者預后Cox模型回歸分析

3 討 論

CML屬多能造血干細胞克隆增生性疾病，其臨床病理過程最初為慢性期，繼之轉變為加速期，最終急變，導致患者死亡[5]。CML患者常伴Ph染色體異常及BCR-ABL融合基因改變，兩者在其發病及進展過程中均有其重要作用，其中BCR-ABL其DH區域、SH3區域均可影響RhoA/LIM/cofilin等通路調節，影響肌動蛋白骨架重塑，對細胞黏附、遷移、增殖分化產生影響，促進CML發病及進展[6]。既往常通過檢測BCR-ABL轉錄水平來評定CML治療反應性及預后。但研究發現，前期治療方案、年齡、白細胞計數等因素均可能對其預測效果產生影響[7-8]。BARRETT等[9]表示，白血病祖細胞與骨髓基質纖維黏連蛋白黏附改變同樣是引起CML發病的重要機制。細胞周期調節紊亂、細胞黏附異常為CML另一特點，其黏附、運轉及遷移過程涉及肌動蛋白骨架應力形成、整合素黏著斑信號通路、細胞外基質信號調控等過程，而F-actin在上述信號通路調節中有重要作用，其可通過與整合素細胞內部分相連共同參與細胞與細胞外基質信號傳導過程。CFL1則為F-actin關鍵調控蛋白，定位于11q13染色體，系低相對分子質量肌動蛋白解聚因子家族成員，可識別及剪切與單體肌動蛋白，調節其聚合、解聚，并可通過影響F-actin表達，調節黏著斑信號，影響細胞黏附、形態變化及維持。且動物實驗發現，CFL1可調控肌動蛋白表達，影響轉錄因子定位，誘導細胞凋亡及周期調控[10]。早期已被證實CFL1持續激活可增加結腸癌、前列腺癌細胞增殖、侵襲能力，系腫瘤細胞侵襲、轉移的關節調控因子，可影響細胞運動，調動肌動蛋白骨架重組，誘導腫瘤侵襲、轉移[11-12]。何雯等[13]研究發現，CFL1為轉化生長因子信號通路的下游分子，其可通過強化轉化生長因子作用增加腫瘤細胞侵襲性，促進腫瘤進展，導致其復發、轉移。

本研究發現，與健康者比較，CML患者CFL1表達水平明顯降低，CML患者其外周血單個核細胞成分主要為相對成熟中晚幼粒細胞，而健康者其外周血單個核細胞均為成熟細胞[14]，考慮到CML患者CFL1水平降低可能與其參與血液系統粒細胞分化有關。而進行預后相關因素分析發現，年齡、白細胞計數、血小板計數、Ph染色體、骨髓原始細胞百分比、CFL1表達水平均對CML患者生存預后產生影響，一般Ph染色體畸變常出現CML加速期或急變期，提示預后差，主要與染色體異常可能改變CML患者白血病細胞生物學特性有關。且高齡患者其機體免疫抵抗力低下，各機能處于逐漸退化過程，預后通常較差。而骨髓原始細胞百分比增加則提示細胞形態發生異常改變、粒細胞系統核漿發育不平衡，增加CML病變風險。白細胞及血小板計數則為CML患者疾病狀態的重要體現，持續血小板減少，白細胞計數上調，導致其聚集于骨髓內，進一步影響CML患者骨髓正常造血功能，增加全身血液擴散程度，促進疾病進展，影響患者預后[15-16]。此外，低CFL1表達是影響患者預后的重要因素，其表達水平的變化與CML患者細胞分化程度及疾病狀態均有其關聯，表達上調，可影響F-actin聚集及解聚，調節整合素黏著斑信號通路，改變細胞間黏附反應。而其表達下調，上述各因子作用減弱，F-actin解聚功能遭到抑制，暴露肌動蛋白家族激酶信號轉導及細胞骨架蛋白質，導致骨髓間質黏附作用增強，促進細胞活化，增加細胞移行速度，強化細胞侵襲、轉移能力，促進膠質母細胞腫瘤運動，促進疾病進展，影響其預后。

4 結 論

CML患者較健康者CFL1表達水平較低，且年齡、白細胞計數、血小板計數、Ph染色體、骨髓原始細胞百分比、CFL1表達均為影響CML患者預后的相關危險因素。