輸注儲存紅細胞對患者循環游離血紅蛋白、一氧化氮和結合珠蛋白的影響*

李秀偉，胡曉麗，施中凱，金 薇，姜月紅，馮恩航，蔣 蕊，劉惠敏，楊淑莉

(黑龍江省醫院：1.輸血科；2.感染科；3.實驗診斷部；4.財務科，黑龍江哈爾濱 150036)

輸注儲存紅細胞是一種經驗性治療方法，至今仍然是緩解大量失血、嚴重貧血、骨髓抑制、紅細胞異常破壞患者的重要治療手段。近年來，有關輸血不良反應與離體紅細胞經長期儲存產生“儲存損傷”，即紅細胞經過體外長時間的低溫儲存后，紅細胞的代謝、形態結構、生理功能和生化指標等與體內的紅細胞有很大的差異[1]的關系成為研究熱點。現有研究已知，全血離開人體即發生變化，其損傷程度與保存液種類、溫度、時間等因素有關，如果溫度和保存液的種類不變，則儲存損傷的變化隨保存時間而增加；紅細胞懸液隨著貯存時間的延長，細胞內的能量和三磷酸腺苷(ATP)消耗導致紅細胞形態發生變化，其膜結構的改變以及對陽離子主動轉運功能受阻，血紅蛋白(Hb)游離于細胞外[2]；同時，細胞內一氧化氮(NO)及其衍生物含量迅速下降，隨后細胞生化代謝、功能及形態學相繼發生改變[3]。總之，紅細胞經體外儲存發生溶血反應，回輸之后由于紅細胞生存率下降導致血管內溶血，體內游離血紅蛋白(FHb)含量顯著增加，對NO的清除作用增強[4]。

目前，國內對此僅限于動物實驗或體外研究,如通過建立小鼠紅細胞體外儲存系統,模擬臨床輸血，或用于測量庫血的FHb與NO指標，或向庫血中添加NO以觀察其對儲存損傷的改善程度等。本研究觀察患者輸血前后循環FHb水平、NO消耗、結合珠蛋白(HP)情況，旨在了解輸注庫存血對患者循環的影響，以期找到關聯因素，預防相關的輸血不良反應。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年7月至2015年6月在本院骨科、普外科、循環內科、及血液科住院的患者中33例為備選對象。經院級醫學倫理委員會同意，采用每位患者輸血前的檢驗用標本，以及輸血治療后24 h觀察輸血療效的檢驗用標本(醫生往往在輸血后24 h采集血液進行化驗，以獲知和評價輸血療效)，盡量減少患者的痛苦，其余時間點的標本采集必須征得患者及其家屬的同意，方可實施。輸血前的標本規定在輸血治療前1～3 d內，臨床上已有輸注2 U紅細胞懸液的指征和意向，確認已簽署輸血治療知情同意書，然后項目組再跟進，做患者思想工作，同意其他時間點采集標本的請求，同時簽署黑龍江省醫院開展臨床研究、調查、試驗患者知情同意書。完全符合條件的方可成為本研究的受試對象，并由專業護士采取。備選對象中有1例外傷患者輸注8 U以上紅細胞懸液并因死亡退出、1例輸注4 U紅細胞懸液和1例輸注1 U紅細胞懸液者退出研究。最終有30例患者合格，年齡40～90歲，平均(60.2±15.69)歲，男22例，女8例。同時收集患者相關病史資料，如民族、年齡、性別、籍貫等保留資料。

1.2試驗分組 已有研究對結合珠蛋白生成障礙性貧血患者做了儲存紅細胞中NO的變化與輸注效果的研究；也有研究證實了血液腫瘤患者(急性髓系白血病、多發性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、睪丸癌、髓系肉瘤、非霍奇金型B細胞淋巴瘤、骨髓增生異常淋巴瘤)的輸血增加FHb水平和NO的消耗[5]。因此，本研究擬對創傷患者、血管內皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血患者進行研究。創傷組10例，包括外傷和骨折患者術中及病房輸血患者，排除慢性病、血液病、肝、腎功能損害者；內皮損傷組10例，包括糖尿病、高血壓、高血脂、腦卒中、心力衰竭、上消化道出血患者；非珠蛋白生成障礙貧血病組10例，包括缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、骨髓抑制患者。

1.3儀器與試劑 酶標儀(PHOMO2010，鄭州安圖生物)及其配套的NO(批號201501)、HP(批號201501)酶聯免疫試劑盒(上海江萊生物)；半自動生化分析儀(GF-D200，山東高密彩虹)及其測定血漿FHb(批號150619)試劑盒(北京瑞爾達生物科技有限公司)。

1.4檢測指標 輸血前1～3 d采集患者抗凝血3 mL/(人)份(EDTA-K2抗凝)和非抗凝血4 mL/(人)份以半自動生化分析儀檢測FHb，酶標儀檢測NO、HP水平，記錄檢測數據，給予2 U紅細胞懸液[紅細胞懸液均來自黑龍江省血液中心，輸血時距采集、制備和儲存時間是(21±3)d，之所以選擇這個天齡的紅細胞懸液，是因為想研究輸注一定天齡的紅細胞懸液對循環FHb和NO的影響]后，分別于輸血后15 min、1 h、2 h、24 h、1周等時間點采集每例患者與輸血前等量抗凝血和非抗凝血標本，重復檢測并相應記錄檢測數據。

2 結 果

2.1FHb水平：輸血前后有差別(F處理=11.72，P<0.01)；30名患者的FHb水平有差別(F配伍=21.89，P<0.01)；FHb測定：3組間無差別(F=0.43，P>0.05)，見表1。

2.2NO水平：輸血前后有差別(F處理=19.69，P<0.01)；30名患者的NO水平有差別(F配伍=11.967，P<0.01)；NO測定：3組間無差別(F=0.998，P>0.05)，見表2。

2.3HP水平：輸血前后有差別(F處理=7.25，P<0.01)；30名患者的HP水平有差別(F配伍=13.72，P<0.01)；HP測定：3組間無差別(F=0.744，P>0.05)，見表3。

表1 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后FHb變化比較

表2 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后NO變化比較

表3 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后HP變化比較情況

3 討 論

本研究數據證實，患者輸血是一個動態的變化過程，特別是儲存紅細胞重新被輸注進生命體后產生著一系列復雜的級聯反應。首先，紅細胞離開生命體被放入保存液中，經過低溫儲存，如本組輸注的紅細胞儲存期為(21±3)d后，FHb明顯增加，據報道儲存10～30 d的紅細胞血漿中的FHb逐漸增高，20 d已高于正常范圍(40 mg/L)[2]，而且約有25%的紅細胞在輸入患者體內<24 h即被破壞，造成血管內溶血[4]。這就是輸入儲存紅細胞15 min后受血患者體內的FHb明顯增加的原因。

哺乳動物體內NO主要由一氧化氮合酶(NOS)以左旋精氨酸(L-Arg)為底物而合成[6]；根據NO的來源不同，NOS分為：(1)內皮型NOS(eNOS)，存在于血管內皮、支氣管內皮和海馬錐體細胞層；(2)神經型NOS(nNOS),存在于視網膜、植物神經纖維、大腦皮層、骨骼肌細胞和平滑肌細胞等；(3)誘導型NOS(iNOS)，存在于肝細胞、單核巨噬細胞、內皮細胞和成纖維細胞。eNOS與nNOS正常狀態下即可表達，需鈣離子參與，iNOS在多數情況下只在免疫應答和神經損傷后才表達，非鈣離子依賴性[2]。還有一種非酶生性NO，通過供體生成。本研究數據顯示，3組(不同疾病)患者輸血后15 min，其體內血漿中NO有1個短暫性提高。可能是由于機體因輸血對異種基因抗原進入體內，產生的一種免疫應答[7]，存在于巨噬細胞內的iNOS在機體免疫應答時出現表達合成NO所致[2]。

Hb對NO有很強的清除能力。氧合Hb(oxyHb)和NO反應生成硝酸鹽和高鐵Hb(metHb),從而大大降低血管內皮NO的生物利用率。正常情況下，Hb被包裹在紅細胞內，在紅細胞膜的屏障作用下，膜外的非擾動層和血液層流狀態造成與內皮細胞間的無細胞區，NO不被Hb清除；FHb與NO的反應速率是紅細胞內Hb的500～1 000倍[4]。FHb增加后，NO的生物利用率大大降低，這也許就是受血者在輸血后1 h至1周NO大幅下降的原因。

本研究中3組患者的HP水平在輸血后15 min也有1個短暫性的升高，因為HP主要在肝臟合成，是一種急性期時相反應蛋白，當機體處在應激狀態時，血液中的HP明顯增多，如機體處于心肌梗死、腫瘤、炎癥、創傷、感染等病理狀態時，以及應用某些激素，如皮質激素和雄性激素后，其血清HP水平常有顯著提高，可用于鑒別急性、亞急性與慢性病理狀態，在一定程度上與病理損傷的性質和范圍也有相關[6-7]。HP的主要功能是結合FHb，形成穩定的HP-Hb復合物，這種結合使HP和Hb的構型和特征均發生改變。HP-Hb的功能既不同于HP，亦不同于Hb，且這個反應基本上是不可逆的。HP的降解也在肝臟，血漿中的HP 與FHb結合后大部分被輸送至肝臟分解。臨床上有許多病因可造成紅細胞破壞，如創傷、燒傷等，致血液中FHb明顯升高，而HP與FHb結合后形成的復合物可被網狀內皮細胞迅速清除，但該復合物因分子量大，不能通過腎小球濾膜而經尿液排出,故可阻止亞鐵血紅素的漏失,且可防止溶血導致的腎臟受損[8]。最近有研究顯示，Hb與HP一旦結合，即迅速在2個場所肝細胞(90%)和單核細胞/巨噬細胞(10%)之一從血液被清除。對于HP-Hb復合物在肝細胞上的特異性受體尚未被發現，但單核細胞/巨噬細胞上的受體，最近已證實為CD163[9]。CD163(HbSR)是一種迄今為止僅僅在單核-巨噬細胞系統細胞膜上發現的跨膜分子，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體超家族的成員之一。它可以特異性地識別Hb-HP復合體[10]。

當血漿中增高的FHb超過HP的結合能力時，剩余的FHb與血漿中的血結素結合,小部分轉變為高鐵血紅蛋白，與血漿中清蛋白結合形成高鐵血紅素清蛋白；大部分通過腎臟排泄，形成血紅蛋白尿[2]。已經有研究者對HP生成障礙性貧血患者做了儲存紅細胞中NO的變化與輸注效果的研究，證明隨著紅細胞貯存期延長，NO水平有持續下降的趨勢(P<0.01)，紅細胞輸注效率(輸注紅細胞24 h復查Hb，并與輸血前比較，達到預期值是為有效)也隨之下降(P<0.01)[11]。本研究中選定一組非結合珠蛋白生成障礙性貧血患者，在輸注2 U紅細胞懸液15 min后HP有一個大幅度提高,是因為HP應激狀態導致生成增多，當發揮其清道夫功能后，結合FHb后逐漸減少，最后低于輸血前水平；FHb被消耗后，又制約了NO的持續減少。

本研究3組患者(創傷、血管內皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血病)FHb、NO和HP水平變化差異無統計學意義(P>0.05)。輸注儲存紅細胞并不一定因其中FHb增加便影響了NO的利用率而出現輸血患者血漿中NO的持續減少，原因可能在于輸注儲存紅細胞后機體產生一系列的反應，這個過程是在FHb與NO反應、而HP又與FHb反應的互相制約最后達到消長平衡的變化中完成的。