輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞對(duì)患者循環(huán)游離血紅蛋白、一氧化氮和結(jié)合珠蛋白的影響*

李秀偉，胡曉麗，施中凱，金 薇，姜月紅，馮恩航，蔣 蕊，劉惠敏，楊淑莉

(黑龍江省醫(yī)院：1.輸血科；2.感染科；3.實(shí)驗(yàn)診斷部；4.財(cái)務(wù)科，黑龍江哈爾濱 150036)

輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞是一種經(jīng)驗(yàn)性治療方法，至今仍然是緩解大量失血、嚴(yán)重貧血、骨髓抑制、紅細(xì)胞異常破壞患者的重要治療手段。近年來(lái)，有關(guān)輸血不良反應(yīng)與離體紅細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期儲(chǔ)存產(chǎn)生“儲(chǔ)存損傷”，即紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外長(zhǎng)時(shí)間的低溫儲(chǔ)存后，紅細(xì)胞的代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化指標(biāo)等與體內(nèi)的紅細(xì)胞有很大的差異[1]的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。現(xiàn)有研究已知，全血離開(kāi)人體即發(fā)生變化，其損傷程度與保存液種類(lèi)、溫度、時(shí)間等因素有關(guān)，如果溫度和保存液的種類(lèi)不變，則儲(chǔ)存損傷的變化隨保存時(shí)間而增加；紅細(xì)胞懸液隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的能量和三磷酸腺苷(ATP)消耗導(dǎo)致紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，其膜結(jié)構(gòu)的改變以及對(duì)陽(yáng)離子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受阻，血紅蛋白(Hb)游離于細(xì)胞外[2]；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)及其衍生物含量迅速下降，隨后細(xì)胞生化代謝、功能及形態(tài)學(xué)相繼發(fā)生改變[3]。總之，紅細(xì)胞經(jīng)體外儲(chǔ)存發(fā)生溶血反應(yīng)，回輸之后由于紅細(xì)胞生存率下降導(dǎo)致血管內(nèi)溶血，體內(nèi)游離血紅蛋白(FHb)含量顯著增加，對(duì)NO的清除作用增強(qiáng)[4]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)此僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外研究,如通過(guò)建立小鼠紅細(xì)胞體外儲(chǔ)存系統(tǒng),模擬臨床輸血，或用于測(cè)量庫(kù)血的FHb與NO指標(biāo)，或向庫(kù)血中添加NO以觀察其對(duì)儲(chǔ)存損傷的改善程度等。本研究觀察患者輸血前后循環(huán)FHb水平、NO消耗、結(jié)合珠蛋白(HP)情況，旨在了解輸注庫(kù)存血對(duì)患者循環(huán)的影響，以期找到關(guān)聯(lián)因素，預(yù)防相關(guān)的輸血不良反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年7月至2015年6月在本院骨科、普外科、循環(huán)內(nèi)科、及血液科住院的患者中33例為備選對(duì)象。經(jīng)院級(jí)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，采用每位患者輸血前的檢驗(yàn)用標(biāo)本，以及輸血治療后24 h觀察輸血療效的檢驗(yàn)用標(biāo)本(醫(yī)生往往在輸血后24 h采集血液進(jìn)行化驗(yàn)，以獲知和評(píng)價(jià)輸血療效)，盡量減少患者的痛苦，其余時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本采集必須征得患者及其家屬的同意，方可實(shí)施。輸血前的標(biāo)本規(guī)定在輸血治療前1～3 d內(nèi)，臨床上已有輸注2 U紅細(xì)胞懸液的指征和意向，確認(rèn)已簽署輸血治療知情同意書(shū)，然后項(xiàng)目組再跟進(jìn)，做患者思想工作，同意其他時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本的請(qǐng)求，同時(shí)簽署黑龍江省醫(yī)院開(kāi)展臨床研究、調(diào)查、試驗(yàn)患者知情同意書(shū)。完全符合條件的方可成為本研究的受試對(duì)象，并由專(zhuān)業(yè)護(hù)士采取。備選對(duì)象中有1例外傷患者輸注8 U以上紅細(xì)胞懸液并因死亡退出、1例輸注4 U紅細(xì)胞懸液和1例輸注1 U紅細(xì)胞懸液者退出研究。最終有30例患者合格，年齡40～90歲，平均(60.2±15.69)歲，男22例，女8例。同時(shí)收集患者相關(guān)病史資料，如民族、年齡、性別、籍貫等保留資料。

1.2試驗(yàn)分組 已有研究對(duì)結(jié)合珠蛋白生成障礙性貧血患者做了儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO的變化與輸注效果的研究；也有研究證實(shí)了血液腫瘤患者(急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、睪丸癌、髓系肉瘤、非霍奇金型B細(xì)胞淋巴瘤、骨髓增生異常淋巴瘤)的輸血增加FHb水平和NO的消耗[5]。因此，本研究擬對(duì)創(chuàng)傷患者、血管內(nèi)皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行研究。創(chuàng)傷組10例，包括外傷和骨折患者術(shù)中及病房輸血患者，排除慢性病、血液病、肝、腎功能損害者；內(nèi)皮損傷組10例，包括糖尿病、高血壓、高血脂、腦卒中、心力衰竭、上消化道出血患者；非珠蛋白生成障礙貧血病組10例，包括缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血、骨髓抑制患者。

1.3儀器與試劑 酶標(biāo)儀(PHOMO2010，鄭州安圖生物)及其配套的NO(批號(hào)201501)、HP(批號(hào)201501)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物)；半自動(dòng)生化分析儀(GF-D200，山東高密彩虹)及其測(cè)定血漿FHb(批號(hào)150619)試劑盒(北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司)。

1.4檢測(cè)指標(biāo) 輸血前1～3 d采集患者抗凝血3 mL/(人)份(EDTA-K2抗凝)和非抗凝血4 mL/(人)份以半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FHb，酶標(biāo)儀檢測(cè)NO、HP水平，記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)，給予2 U紅細(xì)胞懸液[紅細(xì)胞懸液均來(lái)自黑龍江省血液中心，輸血時(shí)距采集、制備和儲(chǔ)存時(shí)間是(21±3)d，之所以選擇這個(gè)天齡的紅細(xì)胞懸液，是因?yàn)橄胙芯枯斪⒁欢ㄌ忑g的紅細(xì)胞懸液對(duì)循環(huán)FHb和NO的影響]后，分別于輸血后15 min、1 h、2 h、24 h、1周等時(shí)間點(diǎn)采集每例患者與輸血前等量抗凝血和非抗凝血標(biāo)本，重復(fù)檢測(cè)并相應(yīng)記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1FHb水平：輸血前后有差別(F處理=11.72，P<0.01)；30名患者的FHb水平有差別(F配伍=21.89，P<0.01)；FHb測(cè)定：3組間無(wú)差別(F=0.43，P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2NO水平：輸血前后有差別(F處理=19.69，P<0.01)；30名患者的NO水平有差別(F配伍=11.967，P<0.01)；NO測(cè)定：3組間無(wú)差別(F=0.998，P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3HP水平：輸血前后有差別(F處理=7.25，P<0.01)；30名患者的HP水平有差別(F配伍=13.72，P<0.01)；HP測(cè)定：3組間無(wú)差別(F=0.744，P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 3組不同疾病患者輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞前后FHb變化比較

表2 3組不同疾病患者輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞前后NO變化比較

表3 3組不同疾病患者輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞前后HP變化比較情況

3 討 論

本研究數(shù)據(jù)證實(shí)，患者輸血是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程，特別是儲(chǔ)存紅細(xì)胞重新被輸注進(jìn)生命體后產(chǎn)生著一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先，紅細(xì)胞離開(kāi)生命體被放入保存液中，經(jīng)過(guò)低溫儲(chǔ)存，如本組輸注的紅細(xì)胞儲(chǔ)存期為(21±3)d后，F(xiàn)Hb明顯增加，據(jù)報(bào)道儲(chǔ)存10～30 d的紅細(xì)胞血漿中的FHb逐漸增高，20 d已高于正常范圍(40 mg/L)[2]，而且約有25%的紅細(xì)胞在輸入患者體內(nèi)<24 h即被破壞，造成血管內(nèi)溶血[4]。這就是輸入儲(chǔ)存紅細(xì)胞15 min后受血患者體內(nèi)的FHb明顯增加的原因。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)NO主要由一氧化氮合酶(NOS)以左旋精氨酸(L-Arg)為底物而合成[6]；根據(jù)NO的來(lái)源不同，NOS分為：(1)內(nèi)皮型NOS(eNOS)，存在于血管內(nèi)皮、支氣管內(nèi)皮和海馬錐體細(xì)胞層；(2)神經(jīng)型NOS(nNOS),存在于視網(wǎng)膜、植物神經(jīng)纖維、大腦皮層、骨骼肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等；(3)誘導(dǎo)型NOS(iNOS)，存在于肝細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。eNOS與nNOS正常狀態(tài)下即可表達(dá)，需鈣離子參與，iNOS在多數(shù)情況下只在免疫應(yīng)答和神經(jīng)損傷后才表達(dá)，非鈣離子依賴(lài)性[2]。還有一種非酶生性NO，通過(guò)供體生成。本研究數(shù)據(jù)顯示，3組(不同疾病)患者輸血后15 min，其體內(nèi)血漿中NO有1個(gè)短暫性提高。可能是由于機(jī)體因輸血對(duì)異種基因抗原進(jìn)入體內(nèi)，產(chǎn)生的一種免疫應(yīng)答[7]，存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)的iNOS在機(jī)體免疫應(yīng)答時(shí)出現(xiàn)表達(dá)合成NO所致[2]。

Hb對(duì)NO有很強(qiáng)的清除能力。氧合Hb(oxyHb)和NO反應(yīng)生成硝酸鹽和高鐵Hb(metHb),從而大大降低血管內(nèi)皮NO的生物利用率。正常情況下，Hb被包裹在紅細(xì)胞內(nèi)，在紅細(xì)胞膜的屏障作用下，膜外的非擾動(dòng)層和血液層流狀態(tài)造成與內(nèi)皮細(xì)胞間的無(wú)細(xì)胞區(qū)，NO不被Hb清除；FHb與NO的反應(yīng)速率是紅細(xì)胞內(nèi)Hb的500～1 000倍[4]。FHb增加后，NO的生物利用率大大降低，這也許就是受血者在輸血后1 h至1周NO大幅下降的原因。

本研究中3組患者的HP水平在輸血后15 min也有1個(gè)短暫性的升高，因?yàn)镠P主要在肝臟合成，是一種急性期時(shí)相反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體處在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，血液中的HP明顯增多，如機(jī)體處于心肌梗死、腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷、感染等病理狀態(tài)時(shí)，以及應(yīng)用某些激素，如皮質(zhì)激素和雄性激素后，其血清HP水平常有顯著提高，可用于鑒別急性、亞急性與慢性病理狀態(tài)，在一定程度上與病理?yè)p傷的性質(zhì)和范圍也有相關(guān)[6-7]。HP的主要功能是結(jié)合FHb，形成穩(wěn)定的HP-Hb復(fù)合物，這種結(jié)合使HP和Hb的構(gòu)型和特征均發(fā)生改變。HP-Hb的功能既不同于HP，亦不同于Hb，且這個(gè)反應(yīng)基本上是不可逆的。HP的降解也在肝臟，血漿中的HP 與FHb結(jié)合后大部分被輸送至肝臟分解。臨床上有許多病因可造成紅細(xì)胞破壞，如創(chuàng)傷、燒傷等，致血液中FHb明顯升高，而HP與FHb結(jié)合后形成的復(fù)合物可被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞迅速清除，但該復(fù)合物因分子量大，不能通過(guò)腎小球?yàn)V膜而經(jīng)尿液排出,故可阻止亞鐵血紅素的漏失,且可防止溶血導(dǎo)致的腎臟受損[8]。最近有研究顯示，Hb與HP一旦結(jié)合，即迅速在2個(gè)場(chǎng)所肝細(xì)胞(90%)和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(10%)之一從血液被清除。對(duì)于HP-Hb復(fù)合物在肝細(xì)胞上的特異性受體尚未被發(fā)現(xiàn)，但單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的受體，最近已證實(shí)為CD163[9]。CD163(HbSR)是一種迄今為止僅僅在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)的跨膜分子，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體超家族的成員之一。它可以特異性地識(shí)別Hb-HP復(fù)合體[10]。

當(dāng)血漿中增高的FHb超過(guò)HP的結(jié)合能力時(shí)，剩余的FHb與血漿中的血結(jié)素結(jié)合,小部分轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，與血漿中清蛋白結(jié)合形成高鐵血紅素清蛋白；大部分通過(guò)腎臟排泄，形成血紅蛋白尿[2]。已經(jīng)有研究者對(duì)HP生成障礙性貧血患者做了儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO的變化與輸注效果的研究，證明隨著紅細(xì)胞貯存期延長(zhǎng)，NO水平有持續(xù)下降的趨勢(shì)(P<0.01)，紅細(xì)胞輸注效率(輸注紅細(xì)胞24 h復(fù)查Hb，并與輸血前比較，達(dá)到預(yù)期值是為有效)也隨之下降(P<0.01)[11]。本研究中選定一組非結(jié)合珠蛋白生成障礙性貧血患者，在輸注2 U紅細(xì)胞懸液15 min后HP有一個(gè)大幅度提高,是因?yàn)镠P應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致生成增多，當(dāng)發(fā)揮其清道夫功能后，結(jié)合FHb后逐漸減少，最后低于輸血前水平；FHb被消耗后，又制約了NO的持續(xù)減少。

本研究3組患者(創(chuàng)傷、血管內(nèi)皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血病)FHb、NO和HP水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞并不一定因其中FHb增加便影響了NO的利用率而出現(xiàn)輸血患者血漿中NO的持續(xù)減少，原因可能在于輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞后機(jī)體產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，這個(gè)過(guò)程是在FHb與NO反應(yīng)、而HP又與FHb反應(yīng)的互相制約最后達(dá)到消長(zhǎng)平衡的變化中完成的。